RKIP在肺癌侵袭转移中作用的研究
肺癌是当今世界上严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤，发病率在多数国家呈明显增高趋势，全球每年有超过100万人死于肺癌，约85％为非小细胞肺癌(NSCLC)，世界卫生组织报告肺癌和艾滋病将是21世纪危害人类健康最为严重的两种疾病。目前的治疗包括手术、放疗、化疗等。化疗虽然能改善NSCLC病人的生存率，然而5年存活率仅为15％。肺癌患者死亡率高的原因与癌细胞具有侵袭转移的生物学特性有关。目前肺癌转移的调控机制仍不明确，因此，进一步研究肺癌侵袭、转移及调控的确切分子机制，已成为提高肺癌治疗效果的迫切要求。
Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族。RKIP能与Raf-1结合，从而抑制Raf-1/MEK/ERK信号通路，还参与了对G蛋白偶联受体信号通路和NF-κB信号通路的调控。目前，RKIP在细胞信号调控网络中的作用受到了人们的广泛瞩目，特别是最新发现RKIP具有抑制肿瘤细胞转移的作用。因此，RKIP的研究已成为肿瘤细胞生物学领域中一个新的研究热点。但RKIP在肺癌中的作用及其调控机制如何，当前国内外相关的研究报道不多。
我们首先对肺癌组织中R.KIP、P-RKIP、NF-1B、P-ERK、AKT的蛋白表达进行了检测，了解RKIP与肺癌临床病理学特征的关系及其与P-RKIP、NF-κB、P-ERK、AKT的相关性。进而，我们通过RKIP基因转染体外培养的A549细胞，观察RKIP表达上调后，A549细胞的增殖、凋亡率、侵袭转移能力的变化以及相关蛋白的表达情况：通过RKIP-siRNA干扰体外培养的SK-MES-1细胞，观察RKIP表达下调后，SK-MES-1细胞的增殖、凋亡率、侵袭转移能力的变化以及相关蛋白的表达情况。最后，通过检测RKIP、PTEN启动子区的甲基化，了解RKIP及PTEN基因甲基化在肺癌发生、发展过程中的作用。
第一部分 RKIP在肺癌组织中的表达及临床意义
目的：观察肺癌组织、正常肺组织中RKIP、P-RKIP、AKT、NF-κB和P-ERK的表达，研究RKIP与肺癌临床病理学特征之间的关系及其与P-RKIP、NF-κB、P-ERK、AKT的相关性。
方法：应用RT-PCR和免疫组织化学方法检测肺癌细胞及正常肺组织中RKIP、P-RKIP、NF-κB、P-ERK和AKT的表达，了解RKIP、P-RKIP、NF-κB、P-ERK、AKT与肺癌临床病理学特征的关系。
结果：
1 肺癌组织中的RKIPmRNA相对表达量为（1.292±0.053），癌旁正常肺组织的RKIPmRNA相对表达量为（1.576±0.102），肺癌组织中RKIPmRNA的表达水平显著低于癌旁正常肺组织，组间比较差异有显著统计学意义(P＜0.05)，RKIPmRNA的表达与临床分期、分化程度、生存时间及淋巴结转移相关(P＜0.05)，与性别、吸烟、肿瘤大小无关(P＞0.05)。
2 RKIP、P-RKIP、NF-κB、P-ERK和AKT在肺癌和正常肺组织中的表达情况
2.1 RKIP在肺癌和正常肺组织中的表达情况
在83例肺癌组织中，66例表达阴性或少数微弱表达，仅17例呈高表达，RKIP蛋白的阳性表达率20.5％(17/83)，在65例癌旁正常肺组织中，23例表达阴性或少数微弱表达，42例呈阳性表达，阳性表达率64.6％(42/65)。肺癌组织中RKIP的表达与正常肺组织中的表达比较(x2=29.617)，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.2 NF-κB在肺癌和正常肺组织中的表达
在83例肺癌组织中，26例表达阴性或少数微弱表达，57例呈高表达，NF-κB蛋白的阳性表达率68.7％(57/83)，在65例癌旁正常肺组织中，43例表达阴性或少数微弱表达，22例呈阳性表达，阳性表达率33.8％(22/65)。肺癌组织中NF-1B的表达与正常肺组织中的表达比较(x2=17.768)，差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.3 P-RKIP在肺癌和正常肺组织中的表达
在83例肺癌组织中，66例表达阴性或少数微弱表达，仅16例呈高表达，P-RKIP蛋白的阳性表达率19.3％(16/83)，在65例正常肺组织中，
22例表达阴性或少数微弱表达,43例呈阳性表达，阳性表达率66.2％(43/65)。肺癌组织中P-RKIP的表达与正常肺组织中的表达比较(x2=33.414)，差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.4 AKT在肺癌和正常肺组织中的表达
在83例肺癌组织中，17例表达阴性或少数微弱表达，66例呈高表达，AKT蛋白的阳性表达率79.5％(66/83)，在65例癌旁正常肺组织中，42例表达阴性或少数微弱表达，23例呈阳性表达，阳性表达率35.4％(23/65)。肺癌组织中AKT的表达与正常肺组织中的表达比较(x2=29.617)，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.5 P-ERK在肺癌和正常肺组织中的表达
在83例肺癌组织中，23例表达阴性或少数微弱表达，60例呈高表达，P-ERK蛋白的阳性表达率72.3％(60/83)，在65例癌旁正常肺组织中，44例表达阴性或少数微弱表达，21例呈阳性表达，阳性表达率32.3％(21/65)。肺癌组织中P-ERK的表达与正常肺组织中的表达比较(x2=23.519)，差异有统计学意义（P＜0.05）。
3 RKIP、P-RKIP蛋白的表达及其与肺癌临床病理特征的关系
RKIP和P-RKIP在肺癌组织中的表达水平均显著低于正常肺组织。RKIP与P-RKIP蛋白的阳性表达均与肿瘤瘤体大小、性别以及大量吸烟史无显著性相关(P＞0.05)。RKIP与P-RKIP蛋白的阳性表达与肺癌的分化程度、TNM分期、术后生存期及淋巴结转移有显著性相关(P＜o．05)。
4 RKIP、NF-κB蛋白表达与临床病理特征的关系
RKIP与NF-κB蛋白的阳性表达均与肿瘤瘤体大小、性别以及大量吸烟史无显著性相关(P＞0.05)。肺癌高分化者RKIP蛋白阳性表达率高于低分化者（P＜0.05），而肺癌高分化者NF-κB表达阳性率低于低分化者(P＜0.05)。肺癌中RKIP阳性表达率随着临床TNM分期增加而下降，分期越晚表达率越低，各期间RKIP的阳性率差异有统计学意义（P＜0.05），而肺癌中NF-κB阳性表达率随着临床TNM分期增加而上升，分期越晚阳性表达率越高，各期间NF-κB的阳性率差异有统计学意义(P＜0.05)；术后生存期＜2年者RKIP阳性表达率明显低于≥2年者（P＜0.05），而术后生存期＜2年者NF-κB的阳性表达率明显高于≥2年者(P＜0.05)，肺癌淋巴结转移者RKIP阳性表达明显低于非转移者(P＜0.05），而肺癌转移者NF-κB阳性表达明显高于非转移者(P＜0.05)。
5 AKT、P-ERK、NF-κB蛋白表达与临床病理特征的关系
AKT、P-ERK与NF-κB在低分化肺癌中蛋白阳性表达率高于高分化者(P＜0.05)，三者的阳性表达均与肿瘤瘤体大小、性别以及大量吸烟史无关。肺癌中三者阳性表达率随着临床TNM分期增加而上升，分期越晚表达率越高，各期间三者的阳性表达率差异有统计学意义(P＜0.05)，术后生存期＜2年者AKT、P-ERK与NF-κB阳性表达率明显高于≥2年者(P＜0.05），有淋巴结转移者AKT、P-ERK与NF-1B阳性表达明显高于非转移者(P＜0.05)。
6 肺癌组织中RKIP与P-RKIP、NF-κB、AKT、P-ERK表达的关系
肺癌组织中RKIP与P-RKIP的表达呈正相关关系(P＜0.05);RKIP与NF-κB、AKT和P-ERK的表达呈负相关关系（P＜0.05）。
结论：
1 肺癌组织中RKIP和P-RKIP蛋白表达水平显著低于正常肺组织，P-ERK、AKT及NF-κB蛋白表达水平均显著高于正常肺组织，表明RKIP和P-RKIP的低表达，P-ERK、AKT及NF-κB的高表达与肺癌的发生有关。
2 RKIP低表达与肺癌的分化程度、临床分期，淋巴结转移及生存期有关，RKIP的表达水平随着肺癌淋巴结转移的发展而呈现下调的趋势，提示RKIP表达下调与肺癌的进展及预后有关，并且RKIP低表达者生存期短。
3 P-ERK、AKT及NF-κB高表达与肺癌的分化程度、临床分期，淋巴结转移及生存期有关，提示P-ERK、AKT及NF-κB在肺癌侵袭转移过程中发挥重要作用。
4 在肺癌组织中，RKIP和P-RKIP蛋白表达减少或缺失与肺癌侵袭转移的恶性特征有关，其机制可能是通过激活P-ERK、NF-κB及AKT来实现的，RKIP可能成为治疗肺癌侵袭转移的新靶点。
第二部分上调RKIP的表达对肺癌生物学行为的影响
目的：应用表达RKIP的质粒对A549细胞进行稳定转染，观察上调RKIP对A549细胞的增殖、侵袭力、凋亡率及细胞周期的变化，以及对相关蛋白表达的影响。
方法：RT-PCR和Western-blot方法对A549肺腺癌细胞和SK-MES-1肺鳞癌细胞进行检测，筛选出RKIP低表达肺腺癌细胞A549，进行RKIP质粒转染，转染成功后，应用MTT法绘制生长曲线，应用单层细胞划痕实验和Matrigel侵袭实验，目的在于观察RKIP表达上调后对A549细胞增殖、迁移能力和侵袭力的影响；通过流式细胞术(FCM)观察肺癌细胞的细胞周期和凋亡率的变化。通过Western-blot方法检测肺癌相关蛋白的变化。
结果：
1 RT-PCR结果显示：A549和SK-MES-1两种细胞RKIPmRNA的表达量分别为0.339±0.003、0.748±0.040。A549细胞RKIPmRNA的表达显著低于SK-MES-1细胞(P＜0.05)。Western-blot结果显示：A549、SK-MES-1两种细胞RKIP蛋白的表达量分别为0.400±0.026和1.323±0.003。A549细胞RKIP蛋白的表达显著低于SK-MES-1细胞（P＜0.05）。因此，选择RKIP低表达肺腺癌细胞A549，进行RKIP质粒转染，
2 细胞转染后RKIPmRNA和蛋白的表达
对照组A549细胞中RKIPmRNA和蛋白的表达水平分别为0.339±0.003、0.400±0.026;而转染后A549细胞中RKIPmRNA和蛋白的表达水平分别为0.775±0.041、1.181±0.002。转染组细胞中RKIPmRNA和蛋白的表达均显著高于对照组（P＜0.05）。
3 RKIP对A549肺癌细胞增值的影响
生长曲线示：转染组细胞生长趋势慢于对照组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。
4 RKIP对A549肺癌细胞迁移能力的影响
划痕24h后，我们观察到对照组的细胞迁移了75.23±6.25，而转染的细胞仅迁移42.45±7.87，差异具有显著性(P＜0.05)，48h后，对照组的细胞迁移了57.87±3.18，而转染的细胞仅迁移30.63±3.10，差异具有显著性（P＜0.05）。
5 RKIP对A549肺癌细胞侵袭力的影响
侵袭试验结果显示：对照组侵袭细胞的个数为144±14，而转染组侵袭细胞的个数分别为58±12，转染组侵袭细胞的个数显著低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
6 RKIP对A549肺癌细胞周期和凋亡的影响
流式细胞术检测结果显示：转染组G0/G1、S和G2/M期细胞比例及凋亡率与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。
7 对照组和转染组A549细胞中NF-κB、P-ERK及AKT的蛋白表达
转染空载体的对照组和RKIP转染组NF-κB、P-ERK、AKT的表达均降低，差异具有显著性(P＜0.05)
结论：
1 高转移性A549肺腺癌细胞中RKIP低表达与肺癌细胞的侵袭转移等恶性行为有关。
2 RKIP基因转染后，对肺腺癌A549细胞的体外增殖能力无影响，也不影响A549细胞的细胞周期和凋亡。但能增强A549细胞的体外侵袭能力，提示RKIP基因高表达能抑制A549肺癌细胞的体外侵袭力。
3 RKIP基因转染后，NF-κB、P-ERK及AKT的蛋白表达减少，RKIP调控P-ERK和NF-κB信号传导途径，是否调控AKT途径需进一步研究。
第三部分抑制RKIP的表达对肺癌生物学行为的影响
目的：RKIP-siRNA经脂质体介导转染RKIP高表达肺鳞癌细胞SK-MES-1，观察siRNA对SK-MES-1细胞中RKIP的抑制作用，以及对SK-MES-1细胞生物学行为的变化。
方法：设计和合成可抑制RKIP表达的经过化学修饰的siRNA，经脂质体介导转染RKIP高表达肺鳞癌细胞系，细胞经RT-PCR及Western-blot方法检测RKIPmRNA和蛋白表达情况，选择RKIP-siRNA抑制效率最高的干扰序列进行进一步研究，通过MTT法绘制生长曲线，观察肺癌的增殖情况；通过Matrigel侵袭实验检测肺癌细胞的侵袭力的变化；通过流式细胞术观察RKIP表达降低后对肺癌细胞周期和凋亡率的影响；RKIP基因沉默后，相关信号通路蛋白表达的变化。
结果：
1 与空白组（0.977±0.003）和阴性对照组(0.917±0.041)相比，各干扰组RKIPmRNA相对表达量分别为RKIP-siRNA1（0.276±0.017）、RKIP-siRNA2(0.084±0.005)、RKIP-siRNA3（0.316±0.014），组间差异有统计学意义(P＜0.05)；与空白组（0.822±0.016）和阴性对照组(0.807±0.019)相比，各干扰组RKIP蛋白相对表达量分别为RKIP-siRNA1(0.491±0.012)、RKIP-siRNA2(0.264±0.029)、RKIP-siRNA3（0.401±0.013），组间差异有统计学意义(P＜0.05)。与RT-PCR结果一致，RKIP-siRNA2抑制RKIP蛋白效率最高。
2 细胞增殖实验(MTT)
干扰24h后连续检测1周，生长曲线示：干扰组细胞生长趋势与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。
3 RNA干扰后对各组肺癌细胞侵袭能力的影响
干扰48h后，各组穿过人工基底膜的细胞数目分别为RKIP-siRNA2组为（128±14）个，阴性对照组为（85±15）个。与阴性对照组相比，RKIP-siRNA2组细胞数明显增多，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。
4 RNA干扰后对肺癌细胞周期和细胞凋亡的影响
干扰48h后，流式细胞术对各组细胞凋亡率检测表明：RKIP-siRNA2组和阴性对照组凋亡率分别为（4.106±1.759）％和（3.642±0.789）％，组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)；流式细胞术检测细胞周期，结果显示：RKIP-siRNA2组和阴性对照组相比，RKIP-siRNA2组G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例分别为63.545％±4.349％、24.876％±2.765％12.468％±1.321％。对照组相分别为65.643％±5.213％、23.123％±4.875％11.866％±1.543％。与对照组相比较，RKIP-siRNA2组细胞G0/G1期细胞比例减少、而S期和G2/M期细胞比例增加，但差异无统计学意义(P＞0.05)。
5 RNA干扰后对P-ERK、NF-κB、AKT蛋白表达的影响
转染后与空白组、阴性对照组相比，RKIP-siRNA2组中NF-κB、P-ERK及AKT蛋白相对表达量显著增加，组间差异有统计学意义(P＜0.05);而空白组与阴性对照组相比，组间差异无统计学意义(P＞0.05)
结论：
1 我们采用化学合成siRNA，利用脂质体转染入SK-MES-1肺鳞癌细胞，RT-PCR和Western-blot检测结果显示：干扰后RKIPmRNA和蛋白的表达降低，说明应用RNAi方法可成功沉默SK-MES-1细胞中RKIP基因。
2 RKIPsiRNA对肺鳞癌细胞的体外增殖能力无影响，也不影响肺鳞癌细胞的细胞周期和凋亡。但能使肺鳞癌细胞的体外侵袭力增强，表明RKIP在肺癌的侵袭转移中发挥重要作用。
3 RKIP在肺癌侵袭转移中的作用机制可能与RKIP参与Raf-MEK1/2-ERK1/2、NF-κB及AKT通路的信号转导有关。第四部分RKIP、PTEN启动子区CpG岛甲基化与肺癌生物学行为的关系
目的：DNA甲基化是人类基因组发生最为常见的一种表观遗传学事件，肿瘤形成的机制主要是癌基因的激活及抑癌基因的失活，其中包括癌基因的失甲基化及抑癌基因的异常甲基化和高甲基化。与突变等基因改变不同，基因的甲基化状态是可逆的，这对于肿瘤防治是非常重要的。在人类肿瘤中，RKIP和PTEN是重要的抑癌基因，参与肿瘤的发生及发展，本研究旨在探讨RKIP和PTEN基因启动子区甲基化与肺癌及其临床病理特征的关系。
方法：采用酚氯仿法抽提组织DNA并进行亚硫酸盐处理，采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR，MSP)的方法，进行RKIP和PTEN基因启动子区的甲基化状态检测，分析其与肺癌发生及临床意义。
结果：
1 RKIP和PTEN基因的甲基化检测结果
83例肺癌中RKIP和PTEN基因的甲基化频率分别为45.8％和51.8％；对同一个体的病变周围的正常组织甲基化检测，11例(13.3％)发生RKIP基因的甲基化，13例(15.7％)发生PTEN基因的甲基化。RKIP和PTEN基因甲基化在肺癌组织中显著高于肺正常组织(P=0.000)。RKIP和PTEN基因的甲基化状态与患者的性别、年龄、吸烟状态无关(P＞0.05)
2 RKIP和PTEN基因甲基化与肺癌临床病理特征的关系
肺癌高分化组、中分化组和低分化组RKIP基因甲基化频率分别为60.0％、78.3％和88.6％，组间比较，RKIP基因甲基化频率有显著性差异(P＜0.05)；肺癌高分化组、中分化组和低分化组PTEN基因甲基化频率分别为48.0％、73.9％和80.0％，组间比较，PTEN基因甲基化频率有显著性差异(P＜0.05)。在TNM分期中，Ⅰ+Ⅱ期肺癌RKIP基因甲基化频率为60.5％，Ⅲ+Ⅳ期肺癌RKIP基因甲基化频率为84.4％，两组比较有显著性差异(P＜0.05)；Ⅰ+Ⅱ期肺癌PTEN基因甲基化频率为52.6％，Ⅲ+Ⅳ期肺癌PTEN基因甲基化频率为82.2％，两组比较有显著性差异（P＜0.05）。术后生存期＜2年者RKIP基因甲基化频率为86.4％，≥2年者RKIP基因甲基化频率为66.7％，两组比较有显著性差异（P＜0.05）；术后生存期＜2年者PTEN基因甲基化频率为81.8％，≥2年者PTEN基因甲基化频率为53.8％，两组比较有显著性差异（P＜0.05）。肺癌伴有淋巴结转移者RKIP基因甲基化频率为88.4％，肺癌不伴有淋巴结转移者RKIP基因甲基化频率为70.0％，两组比较有显著性差异（P＜0.05）；肺癌伴有淋巴结转移者PTEN基因甲基化频率为81.4％，肺癌不伴有淋巴结转移者PTEN基因甲基化频率为55.0％，两组比较有显著性差异（P＜0.05）。RKIP与PTEN基因甲基化与肿瘤瘤体大小、病理分型无显著性相关(P＞0.05)。
结论：
1 在肺癌组织中，RKIP基因的甲基化为45.8％，与正常肺组织相比有显著性差异；RKIP甲基化与肺癌的淋巴结转移、临床病理分期及生存期有关，提示，RKIP基因启动子区CpG岛高甲基化是肺癌的发生、发展的主要事件。
2 在肺癌组织中，PTEN基因的甲基化为51.8％，与正常肺组织相比有显著性差异；PTEN甲基化与肺癌的淋巴结转移、临床病理分期及生存期有关，提示，PTEN基因启动子区CpG岛高甲基化在肺癌的发生中起重要作用。并且与肺癌的预后不良有关。
3 RKIP和PTEN基因的高甲基化与肺癌的发生密切相关，RKIP和PTEN基因高甲基化是肺癌发生的重要分子事件。
肺癌;RKIP蛋白;侵袭转移;甲基化
河北医科大学
博士
肿瘤学
刘巍
2011
中文
R734.2
140
2011-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）