RhoA/Rho激酶信号通路在2型糖尿病大鼠心肌纤维化中的作用
糖尿病可出现多种严重并发症，糖尿病心肌病作为糖尿病一种独特的心脏并发症已经得到公认。心肌纤维化是其主要的病理改变之一，是由于心肌成纤维细胞增殖和细胞外基质过度分泌和堆积的结果，最终可导致心力衰竭。抑制成纤维细胞增殖和胶原合成是抑制心肌纤维化的主要作用环节。目前国内对糖尿病心肌病的研究主要集中在形态学改变和细胞因子水平上，对细胞信号转导通路的研究很少。
Rho蛋白为小分子鸟苷酸结合蛋白，它起着“分子开关”的作用。Rho激酶(ROCK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，是最早发现的RhoA下游效应器。对RhoA/ROCK通路的研究是了解细胞生理病理状态下分子机制的基础。临床已证实RhoA/ROCK信号通路在人类疾病状态如高血压，脑卒中和慢性心力衰竭中起着重要的病理生理作用。目前的研究还发现RhoA/ROCK通路与一些器官如肺、肝、肾慢性纤维化有关。c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路是丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族的重要通路之一，参与调控细胞的增殖、分化与凋亡，是多种细胞胞质信号向核内传递的枢钮，并且在多种生长因子致纤维化过程中有着重要作用。研究证实多种生长因子参与了心肌纤维化的形成，其中转化生长因子βi(TGFβi)是最重要的促纤维化生长因子。TGFβi激活受体后，通过磷酸化Smads将胞质信号传递到细胞核内，从而实现对靶基因的调控，参与成纤维细胞的增殖、细胞表型转化和细胞外基质合成等纤维化过程。我们通过体外高糖条件下心肌成纤维细胞培养，确定RhoA/ROCK通路在高糖诱导心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的作用以及ROCK与JNK及TGFβ1/Smad2/3通路的关系，探讨糖尿病心肌纤维化的分子机制。
既往国内对糖尿病心肌病的研究主要应用1型糖尿病模型，对2型糖尿病模型的研究较少。2型糖尿病占糖尿病发病率的90％以上，其心血管并发症是糖尿病患者的主要死亡原因。因此，应用2型糖尿病动物模型研究糖尿病心肌病是非常必要的。高脂饮食能够诱导大鼠产生了胰岛素抵抗，而小剂量链尿佐菌素(STZ)可以造成轻度的胰岛素分泌障碍，所以高脂饮食结合小剂量STZ一次性腹腔注射建立的2型糖尿病大鼠模型，能更好地模拟人类2型糖尿病的自然病程和代谢特征。我们应用此方法成功地建立了2型糖尿病动物模型，并应用高胰岛素正常血糖嵌夹技术进一步验证胰岛素抵抗的存在。
糖尿病心肌纤维化导致了心室舒张和收缩功能失调，最终发生充血性心力衰竭，这与糖尿病病人心血管疾病的高发病率和高病死率密切相关。然而目前还没有更为有效的药物来预防和治疗糖尿病心肌病。这样，更好地了解糖尿病心肌病的发病机制并发展新的治疗药物是非常必要的。法舒地尔是目前唯一一个已经应用于临床的ROCK选择性抑制剂，主要用于治疗蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛。它作用于ROCK的激酶区域ATP结合位点上，既可抑制ROCK1也可抑制ROCK2。临床实验显示脑卒中和心绞痛患者应用法舒地尔后获益。近年来，法舒地尔已经引起了糖尿病相关领域的关注，研究已经证实法舒地尔可以改善糖尿病大鼠肾间质纤维化程度，但法舒地尔在糖尿病心肌纤维化中的作用国内外未见报道，我们在活体动物上进一步证实RhoA/ ROCK通路在糖尿病心肌纤维化发生机制中的作用，并探讨法舒地尔对糖尿病心肌的保护机制。
本研究目的就是在细胞水平和整体动物水平，探讨RhoA/ROCK通路在糖尿病心肌纤维化中的作用及与JNK和TGFβ1/Smad通路的关系，旨在为糖尿病心肌病提供一个新的治疗靶点。
第一部分RhoA/ROCK通路在高糖诱导大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的作用
目的：通过体外高糖条件下大鼠心肌成纤维细胞培养，探讨RhoA/ROCK通路在高糖刺激心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的作用，阐述高糖诱导心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的分子机制。
方法：提取新生SD大鼠心肌成纤维细胞，在体外进行培养，设有对照组(NG:含5.5mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG:含25mmol/L葡萄糖)、高渗透压组（OSM:5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇），NG+fasudil组(50、100μmol/L)，HG+fasudil组(50、100μmol/L)。MTT测定成纤维细胞增殖；ELISA法测定培养液中Ⅰ型胶原产物含量，免疫细胞化学染色法检测成纤维细胞内Ⅰ型前胶原蛋白含量；应用RT-PCR法测定ROCK1、Ⅰ型前胶原mRNA表达；Western blot检测磷酸化MYPT1水平，代表ROCK的活性。
结果：
1 高糖和法舒地尔对心肌成纤维细胞增殖的影响：从MTT结果可知：与对照组比较，高糖组的吸光度值显著增高，较对照组增加32.1％（0.428±0.028比0.324±0.023，P＜0.01）。与高糖组比较，在高糖刺激的细胞中加入法舒地尔(50，100μM)，其吸光度显著降低（分别为0.375±0.020和0.312±0.022），较高糖组分别降低了12.4％(P＜0.05)和27.4％(P＜0.01)。高糖刺激的细胞中加入法舒地尔100μM时，其吸光度与对照组比较没有差异性(0.312±0.022比0.324±0.023，P＞0.05)。高渗透压组的吸光度与对照组比较没有差异性(0.330±0.032比0.324±0.023，P＞0.05)。在正常糖浓度的细胞中加入法舒地尔(50，100μM)，其吸光度与对照组比较没有差异性(P＞0.05)。这些结果提示：高糖显著地促进了心肌成纤维细胞增殖，法舒地尔浓度依赖性地抑制了高糖诱导的细胞增殖。单纯高渗透压不刺激细胞增殖，法舒地尔浓度至100μM时无细胞毒作用。
2 高糖和法舒地尔对Ⅰ型胶原合成的影响：与对照组比较，高糖显著地上调了Ⅰ型前胶原mRNA表达(P＜0.01)。在高糖刺激的细胞中加入法舒地尔(50，100μM)显著地抑制了Ⅰ型前胶原mRNA的上调（与高糖组比较，P＜0.01）。在正常糖浓度的细胞中加入法舒地尔，其Ⅰ型前胶原mRNA表达与对照组比较没有差异性(P＞0.05)。高渗透压组Ⅰ型前胶原mRNA表达与对照组比较没有差异性(P＞0.05)。应用免疫细胞化学的方法观察每个心肌成纤维细胞内Ⅰ型前胶原蛋白含量，染色阳性的细胞胞浆内围绕核呈现黄褐色颗粒，染色强阳性的细胞出现在高糖组，高糖组中平均每个细胞内Ⅰ型前胶原蛋白含量显著高于对照组(P＜0.01)。当高糖刺激的细胞加入法舒地尔(50，100μM)时，浓度依赖性地抑制了Ⅰ型前胶原的蛋白表达（与高糖组比较，P＜0.05，P＜0.01）。在正常糖浓度的细胞中加入法舒地尔以及高渗透压组中Ⅰ型前胶原蛋白含量与对照比较没有差异性(P＞0.05)。应用ELISA方法测定培养基中Ⅰ型胶原产物的含量显示：高糖显著地诱导了Ⅰ型胶原产物的积聚，是对照组的2.5倍（高糖组：731±29ng/ml，对照组：291±21ng/ml，P＜0.01）。当高糖刺激的细胞中加入法舒地尔(50，100μM)时，浓度依赖性地抑制了Ⅰ型胶原产物的积聚(分别为404±19ng/ml和281±26ng/ml，高糖组：731±29ng/ml，P＜0.05，P＜0.01)，其中高糖刺激的细胞中加入法舒地尔100μM时，Ⅰ型胶原产物较高糖组减少了61.6％（281±26ng/ml比731±29ng/ml，P＜0.01），与对照组比较没有差异性（281±26ng/ml比291±21ng/ml，P＞0.05）。在正常糖浓度的细胞中加入法舒地尔以及高渗透压组中Ⅰ型胶原产物与对照组比较没有差异性(P＞0.05)。这些结果提示：高糖促进了心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原的合成，法舒地尔抑制了高糖诱导的Ⅰ型胶原的合成，高渗透压对Ⅰ型胶原的合成没有影响。
3 高糖和法舒地尔对ROCK通路的影响：与对照组比较，高糖显著地上调了ROCK1mRNA表达(P＜0.01)。在高糖刺激的细胞中加入高浓度法舒地尔(100μM)显著地抑制了ROCK1mRNA上调（与高糖组比较，P＜0.01），但低浓度法舒地尔(50μM)不抑制ROCK1mRNA上调(与高糖组比较，P＞0.05)。在正常糖浓度的细胞中加入法舒地尔以及高渗透压组中ROCK1mRNA表达与对照组比较没有差异性(P＞0.05)。肌球蛋白磷酸酯酶靶点亚单位1(MYPT1)是ROCK的主要底物之一，其磷酸化被认为是ROCK活化的重要标志，因此我们检测了MYPT1磷酸化水平用于反应ROCK的活性。成纤维细胞暴露于高糖中显著地增加了MYPT1磷酸化水平（与对照组比较，P＜0.01），当高糖刺激的细胞中加入法舒地尔(50，100μM)时，显著地抑制了MYPT1磷酸化水平的增加（与高糖组比较，P＜0.01）。在正常糖浓度的细胞中加入法舒地尔以及高渗透压组中MYPT1磷酸化水平与对照组比较没有差异性(P＞0.05)。这些结果提示：高糖不但上调了ROCK1mRNA表达，而且刺激了ROCK的活性。法舒地尔抑制了高糖诱导的ROCK活性的增加，高渗透压对ROCK的活性没有影响。
结论：高糖促进了大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成，RhoA/ROCK信号通路介导了高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原合成。
第二部分高糖诱导心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中RhoA/ROCK通路对JNK和TGFβ1/Smad通路的调节作用
目的：通过体外高糖条件下大鼠心肌成纤维细胞培养，探讨心肌成纤维细胞上RhoA/ROCK通路对JNK和TGFβ1/Smad通路的调节作用以及法舒地尔抑制高糖诱导心肌成纤维细胞增殖和胶原合成可能的分子机制。
方法：提取新生SD大鼠心肌成纤维细胞在体外进行培养，设有对照组(NG:含5.5mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG:含25mmol/L葡萄糖)、高渗透压组（OSM:5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇），NG+fasudil组(100μmol/L)，HG+fasudil组(50、100μmol/L)。应用RT-PCR法测定JNKmRNA表达；Westernblot检测磷酸化JNK、磷酸化Smad2/3、TGFβi和c-jun蛋白水平。
结果：
1 高糖和法舒地尔对JNK通路的影响：与对照组比较，高糖显著地上调了JNKmRNA表达，增加了JNK磷酸化水平(P＜0.01)。在高糖刺激的细胞中加入法舒地尔(50，100μM)显著地抑制了JNKmRNA的上调，同时抑制了JNK磷酸化水平的增加(与高糖组比较，P＜0.01)。在正常糖浓度的细胞中加入法舒地尔以及高渗透压组中JNKmRNA表达和磷酸化JNK与对照组比较没有差异性(P＞0.05)。同时我们也观察了JNK底物c-jun的蛋白表达，发现与对照组比较，高糖显著地增加了c-jun蛋白表达(P＜0.01)。在高糖刺激的细胞中加入法舒地尔，显著地抑制了c-jun蛋白表达的增加(与高糖组比较，P＜0.01)。在正常糖浓度的细胞中加入法舒地尔以及高渗透压组中c-jun蛋白表达与对照组比较没有差异性(P＞0.05)。这些结果提示：高糖激活了JNK通路，法舒地尔抑制了高糖诱导的JNK通路的激活，高渗透压对JNK通路没有影响。
2 高糖和法舒地尔对TGFβ1/Smad通路的影响：与对照组比较，高糖显著地增加了TGFβi蛋白表达和磷酸化Smad2/3(P＜0.01)。在高糖刺激的细胞中加入法舒地尔(50，100μM)显著地抑制了TGFβi蛋白及磷酸化Smad2/3的增加(与高糖组比较，P＜0.01)。在正常糖浓度的细胞中加入法舒地尔以及高渗透压组中TGFβi蛋白和磷酸化Smad2/3与对照组比较没有差异性(P＞0.05)。这些结果提示：高糖激活了TGFβ1/Smad2/3通路，法舒地尔抑制了高糖诱导的TGFβ1/Smad2/3通路的激活，高渗透压对TGFβ1/Smad2/3通路没有影响。
结论：ROCK的激活是高糖诱导JNK和Smad2/3通路激活所必需的。JNK和Smad2/3是ROCK的下游信号分子。法舒地尔抑制高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原合成可能部分地是通过抑制JNK和TGFβ1/Smad2/3通路实现的。第三部分RhoA/ROCK通路在2型糖尿病大鼠心肌纤维化中的作用及法舒地尔对心肌的保护效应
目的：在活体动物水平探讨RhoA/ROCK、JNK和TGFβ1/Smad通路在2型糖尿病大鼠心肌纤维化中的作用并确定法舒地尔对心肌纤维化的影响。
方法：高脂饮食结合小剂量STZ（30mg/kg）一次性腹腔注射制作2型糖尿病大鼠模型，并于10w末通过高胰岛素正常血糖嵌夹技术验证胰岛素抵抗的形成；腹主静脉取血测定空腹血糖(FBG)、胰岛素(FINS)、甘油三酯(TG)及胆固醇(TC)。将大鼠分为对照组，糖尿病组和法舒地尔治疗组(10mg/kg/di．p．)。每月测量鼠尾血压。于24w末做心脏功能测定，包括心率(HR)、左室收缩压(LVSP)和舒张末压(LVEDP)、左室压力最大上升和下降速率(±dp/dtmax)；并取血测定FBG、FINS、TC、TG、糖化血红蛋白(HbAlc)。处死动物，留取心肌标本，称取心脏质量；测定心肌组织中羟脯氨酸含量并换算为胶原含量；HE染色光镜下观察心肌的结构和细胞形态，电镜下观察心肌的超微结构。用Masson染色观察心肌胶原沉积情况；免疫组织化学染色观察Ⅰ、Ⅲ型胶原含量。RT-PCR测定Ⅰ、Ⅲ型前胶原、ROCK1、JNK、TGFβi的基因表达；Westem blot检测磷酸化MYPT1、磷酸化JNK、磷酸化Smad2/3、MYPT1、JNK、c-jun和TGFβ1蛋白表达。
结果：
1 体重的变化：10w末，糖尿病大鼠体重明显高于对照组大鼠（328.2±21.72g比276.65±33.18g，P＜0.01）。24w末，糖尿病组和法舒地尔治疗组大鼠体重较对照组明显下降（297.06±35.11g和301.77±37.39g分别比349.10±40.01g，P＜0.01），糖尿病组大鼠和法舒地尔治疗组大鼠比较体重没有差异性（297.06±35.11g比301.77±37.39g，P＞0.05）。
2 血生化指标的改变：10w末，糖尿病组大鼠FBG、FINS、TG显著高于同期对照组大鼠(P＜0.01)，但TC没有差异性(P＞0.05)。24w末，糖尿病组大鼠FBG、FINS、HbA1c、TG及TC显著高于同期对照组大鼠(P＜0.01)，法舒地尔治疗组大鼠与糖尿病组大鼠比较，这些指标没有差异性(P＞0.05)。三组大鼠的鼠尾血压没有差异性(P＞0.05)。
3 胰岛素抵抗指标：10w末进行高胰岛素正常血糖嵌夹试验，结果显示糖尿病组大鼠的葡萄糖输注率(GIR)明显低于对照组大鼠（5.89±1.05mg/kg.min比11.40±1.24mg/kg.min，P＜0.01），说明糖尿病大鼠存在胰岛素抵抗。24w末，应用FBG和FINS计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，HOMA-IR=FBGxFINS÷22.5。糖尿病组和法舒地尔治疗组大鼠的HOMA-IR显著高于对照组（92.72±17.42和81.43±12.81分别比13.70±3.91，P＜0.01)，糖尿病组和法舒地尔治疗组大鼠的HOMA-IR没有差异性(92.72±17.42比81.43±12.81，P＞0.05)。
4 心脏功能测定结果：与对照组大鼠比较，糖尿病组大鼠LVSP和±dp/dtmax显著降低（101±17mmHg比139±21mmHg，P＜0.05；3746±402mmHg/s比6909±597mmHg/s，P＜0.01:3417±409mmHg/s比6811±625mmHg/s，P＜0.01），而LVEDP显著升高（10.99±2.21mmHg比3.51±0.72mmHg，P＜0.01）。法舒地尔治疗组大鼠的LVSP和±dp/dtmax较糖尿病组大鼠显著升高（131±24mmHg比101±17mmHg，P＜0.05；6517±601mmHg/s比3746±402mmHg/s,P＜0.01;5937±513mmHg/s比3417±409mmHg/s，P＜0.01），而LVEDP较糖尿病组大鼠显著降低（4.88±1.17mmHg比10.99±2.21mmHg，P＜0.01）。HR三组之间没有差异性(P＞0.05)。
5 心脏质量及心脏/体质量(HW/BW):糖尿病组大鼠的心脏质量显著高于对照组大鼠（1.03±0.09g比0.91±0.06g，P＜0.01）。法舒地尔治疗组大鼠的心脏质量显著低于糖尿病组大鼠（0.86±0.07g比1.03±0.09g，P＜0.01），与对照组比较没有差异性(P＞0.05)。糖尿病组大鼠的HW/BW显著高于对照组大鼠（3.48±0.17mg/g比2.60±0.10mg/g，P＜0.01）。法舒地尔治疗组大鼠的HW/BW显著低于糖尿病组大鼠(2.67±0.14mg/g比3.48±0.17mg/g，P＜0.01)，与对照组比较没有差异性(P＞0.05)。
6 HE染色结果：对照组大鼠心肌细胞排列整齐、致密，结构清楚。心肌细胞核呈椭圆形。间质可见少量成纤维细胞，核呈梭形，胞浆较少。糖尿病大鼠心肌细胞排列紊乱，结构不清晰。细胞与细胞间隙增大，间质中成纤维细胞增多。法舒地尔治疗组大鼠的心肌细胞排列较致密，成纤维细胞较糖尿病组大鼠显著减少。
7 心肌超微结构的改变：对照组大鼠心肌肌丝排列整齐，心肌线粒体形态正常，嵴结构明显，无肿胀变性，细胞间质胶原含量很少。糖尿病组大鼠心肌肌丝排列紊乱，肌小节结构破坏，线粒体形态异常，嵴较稀疏，间质胶原显著增多。法舒地尔治疗组大鼠的心肌与糖尿病组大鼠比较，上述异常改变明显减轻，肌原纤维排列整齐，线粒体结构基本正常，胶原明显减少。
8 心肌组织胶原含量：糖尿病组大鼠的心肌胶原含量显著高于对照组大鼠（3.664±0.243μg/mg比2.216±0.122μg/mg，P＜0.01）。法舒地尔治疗组大鼠的心肌胶原含量显著低于糖尿病组大鼠（2.292±0.103μg/mg比3.664±0.243ug/mg，P＜0.01），与对照组比较没有差异性(P＞0.05)。
9 Masson染色结果：对照组大鼠心肌细胞间、血管周围可见少量胶原纤维，胶原面积占2.42±0.33％。糖尿病组大鼠心肌间质和血管周围胶原纤维较对照组显著增多，胶原面积占10.15±0.79％(P＜0.01)。法舒地尔治疗组大鼠的心肌胶原面积较糖尿病组大鼠显著减少，占2.20±0.31％(P＜0.01)。
10Ⅰ型和Ⅲ型胶原免疫组化染色结果：与对照组大鼠比较，糖尿病组大鼠心肌组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原显著增多(阳性面积：Ⅰ型胶原38.4±8.2％比11.2±2.9％, p＜0.01;Ⅲ型胶原15.9±4.6％比4.3±1.5％，p＜0.01)。法舒地尔治疗组大鼠的心肌组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原较糖尿病组大鼠显著减少（阳性面积：Ⅰ型胶原13.7±4.1％比38.4±8.2％，p＜0.0i;Ⅲ型胶原5.1±2.3％比15.9±4.6％，p＜0.01）。
11 左心室组织基因表达结果：与对照组大鼠比较，糖尿病组大鼠心肌组织Ⅰ型、Ⅲ型前胶原、ROCK1、JNK和TGFβi mRNA表达显著上调(p＜0.01)。法舒地尔治疗组大鼠心肌Ⅰ型、Ⅲ型前胶原、JNK和TGFβimRNA表达较糖尿病组大鼠显著降低(p＜0.01)，但ROCK1 mRNA表达在法舒地尔治疗组大鼠和糖尿病组大鼠没有差异性(P＞0.05)。
12 左心室组织蛋白表达结果：与对照组大鼠比较，糖尿病组大鼠心肌组织磷酸化MYPT1、磷酸化JNK、磷酸化Smad2/3和TGFβi、c-jun蛋白表达显著增加(p＜0.01)。法舒地尔治疗组大鼠心肌组织磷酸化MYPT1、磷酸化JNK、磷酸化Smad2/3、TGFβi和c-jun蛋白表达较糖尿病组大鼠显著降低(p＜0.01)；
结论：RhoA/ROCK级联通路在2型糖尿病大鼠心肌纤维化中起了重要作用。法舒地尔有效地抑制了糖尿病心肌纤维化，这可能与它抑制JNK和TGFβ1/Smad2/3通路有关，法舒地尔对心肌的这种结构性益处不依赖于血压和血糖的控制。抑制ROCK有可能成为糖尿病心肌病新的治疗靶点。
Rho激酶;转化生长因子β1;法舒地尔;信号通路;糖尿病;心肌纤维化
河北医科大学
博士
内科学
李拥军
2011
中文
R587.2;R542.23
131
2011-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）