糖尿病早期血管内皮功能受损与ox-LDL及其受体表达的关系及罗格列桐的干预作用
最新的流行病学统计表明，目前我国糖尿病( diabetes mellitus，DM)患病率约为9.7％，我国DM患者约9240万人，已成为DM患者总数最多的国家。2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)的特点是糖脂代谢紊乱，高血糖、高血脂和胰岛素抵抗互为因果，导致内皮功能障碍及动脉硬化( atherosclerosis，AS)的发生和发展。从DM的发病前期到发展为DM、DM终末期，血糖逐渐升高，胰岛素的分泌经历了代偿性的分泌增加至分泌相对不足和最终胰岛功能衰竭几个阶段。肝脏是重要的脂代谢器官，并且作为糖原合成、储存和释放的器官在维持血糖平衡上起重要作用，DM时由于糖脂代谢紊乱合并存在，临床上糖尿病人较正常人更多的合并有脂肪肝。DM的主要危害是血管并发症——AS，可涉及全身多个器官。然而，在出现AS临床表现之前，DM初期甚至糖耐量异常期人群，已存在血管内皮细胞功能障碍，表现为内皮素(endothelin，ET)、一氧化氮(nitricoxide，NO)等物质的分泌异常，内皮依赖性血管舒张功能的下降，以及脉膊波传导速度的变化等，同时血液中的一些诸如氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)、胰岛素水平、血脂等的异常均可对血管内皮功能的改变起到作用。Henry等研究表明糖耐量异常与股动脉和肱动脉僵硬度升高相关，提示在T2DM发生以前已经存在有动脉弹性的下降。我们之前的研究显示糖耐量异常期及DM初期患者的血流介导的内皮依赖性血管舒张功能即出现下降，提示患者已存在有早期AS。因此，早期发现DM人群甚至糖耐量异常人群的AS，对其进行早期干预治疗有可能在临床上取得更好的疗效，并具有重大意义。
DM引起大血管、微血管病变的发病机制，目前认为是多种危险因素作用于不同环节所导致的多因素疾病。而这些因素（如长期慢性高血糖、高胰岛素血症、脂肪代谢紊乱等）之间可能存在复杂的交互作用，促成了DM状态下血管病变，即AS的发生、发展。内皮细胞分泌的ET与NO是具有拮抗作用的血管活性物质，NO/ET的失衡可促进AS的发生。内皮型一氧化氮合酶(endothelia nitric oxide synthase，eNOS)是一氧化氮合成的关键酶，在维持血管正常功能中起着重要的作用，是重要的抗AS因子，其表达水平的变化是影响内皮产生具有舒血管活性的NO的重要因素。ox-LDL是在体内由低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)进入动脉壁后被内皮细胞、巨噬细胞等生成的氧自由基及酶类氧化而成，是一种重要的致AS因子，与DM并发症有密切联系，可做为临床上T2DM病人血管并发症的早期预测因子。而血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(lectin like oxidized low density lipoprotein receptor-1，LOX-1)的主要功能是介导血管内皮细胞摄取ox-LDL，使内皮细胞功能发生损伤。研究表明，LOX-1的表达异常是血管内皮细胞功能异常的最早期标志，在粘附分子产生及AS形成中起重要作用。
噻唑烷二酮类药物（thiazolidinediones， TZDs）做为胰岛素增敏剂可改善与胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)相关的代谢紊乱，在临床上被广泛应用，并可直接作用于血管内的过氧化物酶体增殖活化受体γ(proliferators-actived receptorγ，PPARγ)，发挥其血管保护作用，这些作用包括纠正血管重塑和内皮功能紊乱，抑制血管细胞的增殖和迁移，抑制炎症因子的产生和损伤及增强粥样硬化斑块稳定性等。深入研究TZDs在血管保护方面的作用对DM及其并发症和心血管疾病的防治有重要意义。
综上所述，本研究通过临床和动物实验对于T2DM早期血管病变进行从功能至器质性变化的观察，从血清葡萄糖、胰岛素、胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、ET、NO、ox-LDL的变化，到主动脉、肝脏、胰腺组织的光镜下病理学变化，并进一步深入至LOX-1、PPARγ、eNOS的蛋白和mRNA表达，从多方面、多层次进行研究，并应用TZDs进行干预治疗观察上述指标变化情况。又从临床上探讨上述血清学指标与脉搏波传导速度和内皮依赖性血管舒张功能的关系。对于今后临床上T2DM血管并发症的早期发现和防治意义重大。
第一部分2型糖尿病大鼠血清ox-LDL、ET、NO的改变及罗格列酮的干预作用
目的：通过制备2型糖尿病的动物模型，分析血清ox-LDL水平变化与ET、NO改变的关系，并了解罗格列酮的干预作用。
方法：7周龄雄性Wistar大鼠80只，适应性饲养1周后，随机分为对照组、高脂组、糖尿病组、罗格列酮治疗组（糖尿病+罗格列酮治疗）各20只。对照组以普通饮食饲养，高脂组、糖尿病组和罗格列酮组均以高脂饮食饲养4周后，对糖尿病组和罗格列酮治疗组以小剂量链脲佐菌素腹腔注射制备2型糖尿病大鼠模型。2周后39只成模（糖尿病组死亡1只），罗格列酮治疗组予罗格列酮灌胃治疗。于糖尿病成模后6周和12周时处死部分动物取血进行血糖、血脂、胰岛素、氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、内皮素(ET)、一氧化氮(NO)的检测，比较各组间指标变化及各组自身前后的指标变化。
结果：
1糖尿病成模后6周和12周，与对照组相比，罗格列酮治疗组、糖尿病组血糖升高，差异有统计学意义(p＜0.05)；高脂组血糖虽然高于对照组，但差异无统计学意义(p＞0.05)。与对照组比较，高脂组、糖尿病组及罗格列酮治疗组的CHO、TG、LDL-C水平均升高，差异有统计学意义(p＜0.01)。高脂组和糖尿病组的CHO、TG、LDL-C在12周时较6周时升高，差异有统计学意义(p＜0.05)；罗格列酮治疗组CHO和LDL-C在12周时较6周时升高，差异有统计学意义(p＜0.01)；罗格列酮治疗组血糖、TG、HDL-C前后比较无明显变化(p＞0.05)。
2 糖尿病成模后6周时：与对照组比较，高脂组、糖尿病组和罗格列酮治疗组空腹胰岛素水平均升高，差异有统计学意义(p＜0.05)，与高脂组比较，糖尿病组和罗格列酮治疗组空腹胰岛素水平升高，差异有统计学意义(p＜0.05)；糖尿病组胰岛素水平高于罗格列酮治疗组，差异有统计学意义(p＜0.01)。糖尿病成模后12周时：糖尿病组胰岛素水平较对照组、高脂组和罗格列酮治疗组升高，差异有统计学意义(p＜0.01)；对照组、高脂组和罗格列酮治疗组胰岛素水平无统计学差异(p＞0.05）。糖尿病组12周时胰岛素水平6周时升高，差异有统计学意义(p＜0.01)；罗格列酮治疗组12周时胰岛素水平较6周时下降，差异有统计学意义(p＜0.01)。
3 糖尿病成模后6周时：与对照组比较，高脂组、糖尿病组和罗格列酮治疗组ox-LDL升高，分别为22.30士3.75ug/L，27.48士0.64ug/L，25.83士6.96ug/L，差异有统计学意义(p＜0.05)；糖尿病组及罗格列酮治疗组ox-LDL较高脂组略有升高，但无统计学意义(p＞0.05)。糖尿病成模后12周时：糖尿病组ox-LDL较对照组升高，差异有统计学意义(p＜0.01)；糖尿病组ox-LDL较高脂组和罗格列酮治疗组略有升高，但无统计学差异，(p＞0.05)；对照组、高脂组和罗格列酮治疗组间比较无差异(p＞0.05)。高脂组12周时ox-LOX较6周时升高，差异有统计学意义(p＜0.01)；对照组、糖尿病组和罗格列酮治疗组12周时ox-LDL较6周时升高，但无统计学意义(p＞0.05）。
4 糖尿病成模后6周时，与对照组比较，高脂组、糖尿病组及罗格列酮治疗组ET升高，分别为51.90士14.20μg/L，60.32±11.83μg/L，54.13士7.80μg/L，差异有统计学意义(p＜0.01)；而三组间ET比较无统计学差异(p＞0.05)。12周时与对照组比较，高脂组、糖尿病组及罗格列酮治疗组ET升高，差异有统计学意义(p＜0.01)；与高脂组比较，糖尿病组ET升高，差异有统计学意义(p＜0.05)；与罗格列酮治疗组比较，糖尿病组ET升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。各组自身ET水平在6周时与12周时比较无明显变化(p＞0.05）。
5 糖尿病成模后6周和12周时，与对照组比较，高脂组、糖尿病组及罗格列酮治疗组NO降低，差异有统计学意义(p＜0.01)；而6周时三组间NO比较无统计学差异(p＞0.05)。12周时与高脂组比较，糖尿病组NO降低，差异有统计学意义（p＜0.05）；与罗格列酮治疗组比较，糖尿病组NO降低，差异有统计学意义(p＜0.05)。糖尿病组自身NO水平在12周时与6周时比较下降，差异有统计学意义(p＜0.05)；对照组、高脂组和罗格列酮治疗组自身NO水平在6周时与12周时比较无明显变化(p＞0.05)。
结论：
1 糖尿病组大鼠较高脂饮食组大鼠表现出更明显的糖脂代谢紊乱，且随时间延长程度加重。
2 无论是糖尿病组还是高脂饮食组大鼠致动脉硬化因子ox-LDL、ET升高，预防动脉硬化的保护因子NO下降，并随时间延长有加重趋势。
3 罗格列酮可一定程度改善T2DM大鼠的脂代谢紊乱、IR，降低AS致病因子ox-LOX、ET，改善NO/ET失衡。
第二部分2型糖尿病大鼠主动脉、肝脏、胰腺形态学变化及罗格列酮的干预作用
目的：观察2型糖尿病大鼠在成模后6周和12周时主动脉、肝脏、胰腺的病理学变化，以及罗格列酮的干预作用。
方法：动物分组、造模和干预同第一部分，于糖尿病成模后6周和12周时留取动物肝脏、胰腺、主动脉进行HE染色，在光镜下观察各组动物不同组织的病理学。
结果：
16周时对照组、高脂组、糖尿病组及罗格列酮治疗组大鼠主动脉未见明显病理改变。12周对照组大鼠动脉壁未见明显病理改变；高脂组大鼠主动脉内皮不连续，但弹力纤维及平滑肌细胞排列尚整齐，未见浸润的淋巴细胞等病理改变；糖尿病组大鼠主动脉的内皮细胞不连续，平滑肌细胞和弹力纤维排列紊乱，内膜增厚，内皮下间隙增宽，内皮细胞表面可见浸润的淋巴细胞；罗格列酮治疗组亦存在不同程度病理改变程度，但较糖尿病组减轻。
26周时对照组大鼠肝细胞未见明显病理改变；糖尿病组及高脂组可见部分肝细胞脂肪变性，细胞内可见大小不一脂肪滴，肝细胞结构尚清晰；罗格列酮治疗组肝细胞结构较清晰，小部分细胞脂肪变性，细胞内可见大小不一脂肪滴，但程度较糖尿病组减轻。12周时对照组大鼠肝组织及细胞未见明显病理改变。高脂组大鼠肝细胞排列欠规则，细胞明显脂肪变性，细胞可见大小不一的脂肪滴形成，部分肝细胞的细胞核变小，固缩。糖尿病组大鼠这种病变表现更明显，肝组织结核及肝细胞排列紊乱，绝大部分肝细胞存在大泡性脂肪滴，细胞核大小不一，部分显示不清，部分固缩；罗格列酮治疗组大鼠的肝细胞仍存在脂肪变性，但情况较高脂组和糖尿病组明显减轻。
36周时对照组、高脂组大鼠胰岛形态结构完整、清晰，胰腺腺泡之间可见散在分布浅粉色胰岛细胞团，呈圆形或椭圆形，胰岛中心部位可见较多数量的β细胞，而糖尿病组和罗格列酮治疗组大鼠胰岛结构完整性破坏，胰岛中心部位β细胞数量减少。12周时对照组大鼠胰岛未见明显病理改变；高脂组胰岛结构尚完整，浅粉色胰岛细胞团散在分布，但胰岛中心β细胞数量略有减少；糖尿病组胰岛周围组织完整性破坏，胰岛细胞团数量减少，体积变小，胰岛中心β细胞数量减少，细胞胞质着色浅，空泡增多，细胞核固缩。罗格列酮治疗组上述情况有所改善，胰岛细胞团体积较糖尿病组大，胰岛中心β细胞数量均较糖尿病组多，仅见小部分细胞核固缩。
结论：
1 糖尿病造模成功后予罗格列酮治疗6周时光镜下观察，高脂组和糖尿病组大鼠主动脉形态学改变不明显，但高脂组肝脏发生病理学变化，糖尿病组和罗格列酮治疗组的肝脏和胰腺形态学均已发生病理变化。
2 糖尿病造模成功后予罗格列酮治疗12周时光镜下观察，高脂组、糖尿病大鼠主动脉、胰腺和肝脏均发生病理改变。
3 罗格列酮治疗组上述病变呈不同程度减轻，考虑作用可能与其改善胰岛素抵抗及糖脂代谢紊乱有关。
第三部分2型糖尿病大鼠肝脏及主动脉的LOX-1、eNOS、PPARγ蛋白和mRNA表达及罗格列酮的干预作用
目的：观察2型糖尿病大鼠成模后6周、12周氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)、内皮型一氧化氮酶(eNOS)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在主动脉和肝脏的蛋白，以及主动脉的mRNA表达，并观察罗格列酮对表达的影响。
方法：动物分组、造模和干预同第一部分，于糖尿病成模后6周和12周时留取动物肝脏、主动脉组织进行LOX-1、eNOS、PPARγ的蛋白表达，主动脉的mRNA表达检测，观察比较各组动物的表达差异。
结果：
1 糖尿病成模后6周和12周时，与对照组和高脂组比较，糖尿病组和罗格列酮治疗组主动脉LOX-1的蛋白表达上调，差异有统计学意义(P＜0.01);6周时高脂组主动脉LOX-1的蛋白表达较对照组上调，但无统计学差异(P＞0.05)；6周时罗格列酮治疗组较糖尿病组主动脉LOX-1的蛋白表达下调，差异有统计学意义(P＜0.05)；6周时罗格列酮治疗组较高脂组主动脉LOX-1的蛋白表达上调，但无统计学差异(P＞0.05)。高脂组、糖尿病组和罗格列酮治疗组12周时与6周时比较主动脉LOX-1的蛋白表达上调，差异有统计学意义（P＜0.01）。
2 糖尿病成模后6周和12周时，与对照组比较，高脂组、糖尿病组和罗格列酮治疗组主动脉eNOS的蛋白表达下调，差异有统计学意义(P＜0.01);糖尿病组较高脂组和罗格列酮治疗组主动脉eNOS的蛋白表达下调，差异有统计学意义(P＜0.01);罗格列酮治疗组较高脂组主动脉eNOS的蛋白表达下调，但差异无统计学意义（P＞0.05）。糖尿病组和罗格列酮治疗组主动脉12周时与6周时比较eNOS的蛋白表达下调，差异有统计学意义(P＜0.01)。
3 糖尿病成模后6周和12周时，与对照组比较，高脂组、糖尿病组和罗格列酮治疗组主动脉PPARγ的蛋白表达上调，差异有统计学意义(P＜0.05)；糖尿病组较高脂组和罗格列酮治疗组PPARγ的蛋白表达上调，差异有统计学意义(P＜0.01)。
4 糖尿病成模后6周时，糖尿病组大鼠肝脏较对照组和高脂组的LOX-1表达上调；12周时，高脂组、糖尿病组和罗格列酮治疗组肝脏的LOX-1表达均较对照上调，差异有统计学意义(P＜0.05），糖尿病组和罗格列酮治疗组较高脂组的LOX-1表达上调，差异有统计学意义(P＜0.01);6周和12周时罗格列酮治疗组肝脏LOX-1较糖尿病组表达下调，差异有统计学意义(P＜0.01)。
5 糖尿病成模后6周和12周时，与对照组比较，高脂组、糖尿病组和罗格列酮治疗组肝脏eNOS表达下调，差异有统计学意义(p＜0.01)；与高脂比较，糖尿病组和罗格列酮治疗组的eNOS表达下调，差异有统计学意义(p＜0.01);12周时罗格列酮治疗组较糖尿病组肝脏的eNOS表达上调，差异有统计学意义（P＜0.01）。
6 糖尿病成模后6周和12周时，与对照组比较，高脂组、糖尿病组和罗格列酮治疗组的PPARγ表达上调，差异有统计学意义(P＜0.01)；糖尿病组和罗格列酮治疗组较高脂组的PPARγ表达上调，差异有统计学意义(P＜0.01);罗格列酮组较糖尿病组的的PPARγ表达下调，差异有统计学意义(P＜0.01)。
7 糖尿病成模后6周和12周时，与对照组比较，高脂组、糖尿病组和罗格列酮治疗组主动脉LOX-1的mRNA表达上调，差异有统计学意义(P＜0.05);与高脂组比较，糖尿病组和罗格列酮治疗组主动脉LOX-1的mRNA表达上调，差异有统计学意义（P＜0.05）；罗格列酮治疗组较糖尿病组LOX-1的mRNA表达下调，差异有统计学意义(P＜0.01)。
8 糖尿病成模后6周和12周时，与对照组比较，高脂组、糖尿病组和罗格列酮治疗组主动脉eNOS的mRNA表达下调，差异有统计学意义(P＜0.01)；与高脂组比较，糖尿病组和罗格列酮治疗组主动脉eNOS的mRNA表达下调，差异有统计学意义(P＜0.05)；罗格列酮治疗组较糖尿病组eNOS的mRNA表达上调，但无统计学差异（P＞0.05）。
9 糖尿病成模后6周和12周时，与对照组比较，高脂组、糖尿病组和罗格列酮治疗组主动脉PPARγ的mRNA表达上调，差异有统计学意义(P＜0.05)；与高脂组比较，糖尿病组和罗格列酮治疗组主动脉PPARγ的mRNA表达上调，差异有统计学意义(P＜0.05)，P＜0.05；罗格列酮治疗组较糖尿病组PPARγ的mRNA表达下调，差异有统计学意义(P＜0.01)。
结论：
1 高血糖、高血脂均可导致大鼠肝脏及主动脉LOX-1、eNOS和PPARγ的蛋白表达异常，以及主动脉的mRNA表达异常，且高血糖和高血脂合并存在时其表达异常更明显。
2 LOX-1、eNOS和PPARγ蛋白和mRNA表达异常发生于动脉硬化病理改变之前。
3 噻唑烷二酮类药物对这种表达的紊乱有一定逆转作用，从而发挥其抗炎、抗AS作用。
第四部分高血糖人群早期血管功能改变及相关因素探讨
目的：采用血管外超声技术及动脉硬化测定仪评价高血糖人群早期血管功能的改变，并探讨其相关影响因素。
方法：选取糖耐量异常者45例，初诊2型糖尿病者40例，年龄35～45岁，除外心脑血管疾病及其它疾病。另选取健康体检者30例做为对照组。分别测量身高、体重、血压，检测空腹血糖、餐后血糖、血脂、ox-LDL、ET，应用高分辨率超声检测肱动脉对反应性充血的舒张反应，应用动脉硬化测定仪测定其脉搏波传导速度，比较三组人群各项指标差异，并分析其相关性。
结果：糖尿病组和糖耐量异常组体重指数显著高于对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)，但糖尿病组与糖耐量异常组比较体重指数无统计学差异（p＞0.05）。糖尿病组、糖耐量异常组和对照组收缩压、舒张压、脉压比较无统计学差异(p＞0.05)。脉搏波传导速度从对照组至糖耐量异常组、糖尿病组依次升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。内皮依赖性血管舒张功能从对照组至糖耐异常组、糖尿病组依次降低，差异有统计学意义(p＜0.05)。空腹血糖、餐后血糖、胆固醇、甘油三脂、内皮素和ox-LDL从对照组至糖耐异常组、糖尿病组依次升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。空腹血糖、餐后血糖、脉压差、收缩压、ET、内皮依赖性血管舒张功能、ox-LDL与脉搏波传导速度相关，相关系数分别为r=0.743,0.762,0.807,0.759,0.774,0.790,0.822。
结论：
1 糖耐量异常期和DM初期即存在早期AS，表现为血管内皮功能受损及血管壁弹性下降，应予以早期干预。
2 内皮素和氧化型低密度蛋白可以做为动脉硬化的早期预测因子。
3 脉搏波传导速度和血流介导的内皮依赖性血管内皮功能检测可做为临床上糖尿病或糖耐量异常人群AS的早期检测手段。
2型糖尿病;血管功能;低密度脂蛋;罗格列桐;干预作用
河北医科大学
博士
内科学
宋光耀
2011
中文
R587.1
121
2011-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）