微管相关蛋白-4在小鼠牙胚组织中的表达的研究
目的:
哺乳动物牙齿发育过程可分为牙胚的发生、牙胚的形成、细胞的分化、牙体组织的形成、牙根的发育以及牙齿的萌出。早期的牙胚发育过程包括蕾状期、帽状期和钟状期。
众多的信号分子参与了牙胚发育过程的调节，其中包括TGF-β(transforming growth factor-β，转化生长因子-β)，Wnt(wingless int，Wnt信号)，FGF（fibroblast growth factor，成纤维细胞生长因子），Shh（sonic hedgehog，音猬因子）以及Syndecans(粘结蛋白聚糖）等。根据Ulrika等的研究，Syndecans作为信号分子的协同受体，其作用的实现依赖于微管蛋白的重排列，而微管蛋白的功能受到微管相关蛋白的调节。MAP-4(microtubule-associated protein-4，微管相关蛋白-4)和β-tubulin(β-微管蛋白)分别是微管相关蛋白及微管蛋白中的重要一员，与细胞的多种生理活动密切相关。研究它们在牙胚发育过程中分布和表达的变化有助于我们更深入的认识牙胚发育过程中信号传递的过程和机制。
小鼠磨牙的发育过程，作为哺乳类动物牙齿发育的模型，已经被广泛应用于牙胚发育及信号调节方面的研究。本研究运用免疫荧光显微技术和免疫印迹技术研究不同发育阶段的小鼠磨牙组织中MAP-4及β-tubulin的分布和表达，探讨其对牙胚发育的影响。
材料和方法:
分别取胚胎(embyro，E)为13d、14d、15d、16d、18d的孕鼠，乙醚麻醉下剖开子宫，取出胎鼠鼠头；取出生后( post natal，PN)1d、3d的幼鼠鼠头。最后上述鼠头组织立即进行液氮速冻，入-80℃深冻冰箱保存，于恒冷箱中制作下颌第一磨牙冠状位冰冻切片（7μm厚），而后密封保存于-20℃冰箱待用。采用H-E染色进行下颌第一磨牙的精确定位。选出质量良好的切片，以抗MAP-4和抗β-tubulin的多克隆抗体为-抗进行免疫荧光染色，在荧光显微镜下观察二者在小鼠牙胚发育过程中的表达情况。
在解剖显微镜下提取E15d和E18d胎鼠的下颌第一磨牙牙胚，称重后按1：5比例加入生理盐水，在冰上剪碎样品，4℃500g离心5min，弃上清。按1:3比例加入蛋白裂解液，超声粉碎，4℃裂解过夜。4℃12000g离心30min，取上清，BCA检测试剂盒进行蛋白定量，每管30μg分装，-80℃冻存备用。运用免疫印迹技术(Western blot)检测MAP-4及β-tubulin的蛋白表达水平。
结果:
免疫荧光染色结果显示MAP-4和β-tubulin在各个时期的牙源性上皮和牙乳头内均有表达，且随着发育的成熟，其表达逐渐增强。但到硬组织形成期，二者的表达开始减弱。MAP-4表达于细胞质内，呈点块状，β-tubulin表达于细胞膜下，呈线状。免疫印记的结果显示MAP-4和β-tubulin在E15d和E18d的小鼠牙胚组织蛋白水平上均有表达，且后一时期比前一时期表达的灰度值要深。
结论:
1、MAP-4是牙胚组织细胞中微管蛋白的聚合和解离的调节蛋白。
2、MAP-4对微管蛋白聚集和解离的调节与成釉细胞和成牙本质细胞的分化紧密相关。
3、MAP-4和β-tubulin参与了牙胚的发育以及牙体组织的形成过程。
微管相关蛋白-4;B-微管蛋白;牙胚发育;细胞骨架;信号传递
中国医科大学
硕士
口腔临床医学
高洁
2011
中文
R781
37
2011-08-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）