产热凝胶粪产碱杆菌的生理代谢研究
热凝胶是由粪产碱杆菌或土壤杆菌发酵产生的一种新型微生物胞外多糖,其安全无毒并且具有独特的理化性质,可广泛应用于食品、医药和化工等领域。热凝胶的发酵过程属于典型的生长非偶联型,发酵液中氮源耗尽后才开始合成多糖。由于氮源的缺乏,使得热凝胶合成期间细胞内相关酶的合成及其活性的恢复受到极大的限制,造成热凝胶合成速率的降低和发酵过程控制的困难。本文以高产热凝胶粪产碱杆菌WX-C12为研究对象,运用蛋白质组学技术,对热凝胶发酵过程中,氮源耗尽前后菌体总蛋白的表达变化进行了分析和鉴定;并且比较了粪产碱杆菌及其ntrC突变株生理代谢水平的差异,ntrC基因是氮源代谢调控组分NtrC蛋白的编码基因,从而对NtrC蛋白在调控热凝胶合成中的作用有了初步认识;另外本文还研究了Mn2+对热凝胶合成的影响情况,以了解Mn2+在菌体生理代谢中的作用。
本文首先确立了蛋白分辨率高且重复性较好的粪产碱杆菌菌体总蛋白双向电泳图谱的构建方法:使用蛋白质裂解液提取菌体总蛋白,然后选择pH4-7的IPG预制干胶条和适宜的等电聚焦程序进行第一向等电聚焦电泳,最后比较了考马斯亮蓝和硝酸银两种染色方法对双向电泳图谱的影响。
随后利用上述构建的方法分别对热凝胶发酵过程中氮源耗尽前后的菌体总蛋白进行双向电泳分析,用PDQuest8.0.1软件分析得电泳图谱中共有20个蛋白表达水平发生显著变化。选取其中5个蛋白进行质谱鉴定,成功鉴定出3个已知功能的蛋白,其中烯酰ACP还原酶与菌体生长受阻有关。
另外,本文还对粪产碱杆菌和其ntrC突变株的菌体形态和热凝胶生产特性进行了比较。与原始菌株相比,ntrC突变株培养18 h后菌体形态有很大不同;并且其菌体生长和热凝胶合成的能力显著降低,证明了ntrC基因在热凝胶合成中具有重要的调控作用。同时采用双向电泳技术对ntrC突变株和原始菌株的菌体总蛋白进行分析发现有约40个蛋白没有在ntrC突变株中表达,有43个蛋白表达水平发生显著变化。通过飞行质谱成功鉴定得4个表达水平显著变化的蛋白,其中的N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶和核苷二磷酸激酶与氮源代谢和热凝胶合成有关。
Mn2+对热凝胶合成影响的研究结果表明,摇瓶发酵18 h时提高培养基中MnCl2浓度至0.13 g/L,热凝胶产量提高到22.3 g/L,与对照组相比提高了45.3％。并且通过测定菌体胞内UDP-Glucose的含量发现,提高Mn2+浓度后胞内UDP-Glucose含量总体降低,由此推测Mn2+对热凝胶合成的关键酶糖基转移酶的活性有一定促进作用。
热凝胶;粪产碱杆菌;蛋白质组学;生理代谢
江南大学
硕士
生物化工
詹晓北
2010
中文
TQ920.6
2011-08-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）