不同n-3PUFA对轻中度血脂增高人群血脂及炎症细胞因子影响的随机、双盲对照研究
2005年,心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVD)已成为全球占首位的死亡因为,在全年总共5,800万的死亡人口中,30％死于心血管疾病。在我国,自20世纪90年代起,CVD已成为城乡居民的第一位死因,目前已占总死亡人数的近40％。心血管疾病的发生、致死与膳食结构、生活方式密切相关。膳食无疑起着举足轻重的作用,许多食物成分直接或间接参与了机体血压、血脂、血糖的调节及动脉粥样硬化形成的病理过程,进而影响CVD的发生发展。
n-3脂肪酸对心血管疾病的保护效应从上世纪80年代Kromhout首次发表鱼对冠心病有预防作用以后就受到广为关注。随后20年里,研究不断证实鱼类食物或鱼油中富含的EPA/DHA对CVD的保护作用。GISSI—Prevenzione试验报道,每天补充850mgEPA/DHA可使心肌梗塞病人总死亡率降低20％,并使心源性猝死的发生率下降45％。He等进行了一项Meta分析,认为摄入鱼类与致死性CHD呈负相关,每周摄入一次以上的鱼可能与CHD死亡率的下降有关。n-3脂肪酸对心血管疾病具有调节血浆脂质及脂蛋白,调节类二十烷酸代谢,抗心律失常,改善血小板功能,抗凝及调节机体免疫细胞功能等多重保护效应。但是,生态环境改变,地域与文化的差异以及个体对食物的偏好都使得摄入鱼类保护心血管健康的举措难以实施。
除了来源于鱼类等水产品的EPA和DHA外,食物中的n-3脂肪酸还包括来源于植物种子的α-亚麻酸(ALA)。相对于EPA/DHA而言,膳食中ALA的来源较为丰富,如大豆油,低芥酸菜籽油、亚麻籽油,核桃等。从理论上讲,ALA是人体的必需脂肪酸,其意义在于ALA在体内可以通过碳链在羧基端的延伸和去饱和,衍生为长链的n-3脂肪酸(EPA/DHA),从而产生生物学效应。但关于ALA摄入与CVD的发病及预防的研究结果并不一致,有流行病调查显示,增加ALA的摄入量约1倍,可使冠心病的发生率下降45％。脂肪细胞内ALA的构成从0.36％增加到0.75％,罹患非致死性心肌梗塞的危险性下降约77％。而在挪威进行的一项一年的干预试验,未发现每天摄入5.5gALA对CHD死亡率有改善作用。在2006年一篇综述中,Calder认为与其他膳食干预手段相比,增加ALA摄入量在转化为EPA/DHA及改变心血管危险因素方面并没有优势。显示ALA对CVD的保护效应尚存争议。
为了获得更直接的证据,学者们展开了一系列不同来源n-3脂肪酸对CVD危险因素的影响的比较研究,Wang等认为ALA在减少心脏猝死和中风方面,并不具备和EPA/DHA相一致的健康效应。大型流行病调查显示膳食中EPA/DHA的摄入量与sICAM-1及sVCAM-1呈负相关,而ALA摄入量与CRP,IL-6及E-selectin呈负相关。Yvonne等给150名健康成人分别补充0.7/1.7gEPA/DHA及4.5/9.5gALA,6个月后,1.7gEPA/DHA组干预后TG水平显著下降与9.5gALA组比较差异有显著性,9.5gALA组TG呈上升趋势；。另一项研究则报道与每天补充3.5gALA相比,每天补充EPA/DHA0.44到0.94g之间就能使PBMCs培养上清中释放的IL-6下降。
分析上述研究结果不一致的因为可能有多种,如n-3摄入量、摄入方式、研究对象选择标准等,以及膳食背景和遗传背景都可能影响n-3的健康效应。George等报道,分别给习惯摄入地中海膳食或西方膳食的血脂异常人群进行为期12周,8.1gALA/d,的干预,结果显示,补充ALA降低血清炎症因子的效应对后者(饮食中富含饱和脂肪酸且单不饱和脂肪酸较少的人群)更为显著,显示,膳食背景对n-3的健康效应产生显著的影响。此外,一些关于n-3脂肪酸与基因多态性交互作用的报道,也显示炎症相关遗传因素对膳食脂肪酸的健康效应有一定程度的影响。ALA是我国传统膳食中n-3PUFA的主要来源,确定ALA对心血管疾病的保护效应,通过膳食脂肪及脂肪酸的调整来预防心血管疾病具有特殊意义。在我国居民传统膳食及特殊遗传背景下,研究和比较AALA和EPA/DHA对血脂及炎症细胞因子影响健康效应的差异,对确定ALA作为必需脂肪酸的营养学意义,合理利用食物资源,以及为膳食脂肪酸DRI修订有重要的实际意义。
综上所述,本研究首先以纳入筛选的基础人群为对象,就其膳食n-3脂肪酸摄入、红细胞膜n-3脂肪酸构成与基因的交互作用开展横断面研究。探讨炎症因子IL-6启动子区域基因多态性与n-3脂肪酸对血脂影响的交互作用。进一步在横断面人群中,招募血脂轻中度增高的志愿者,开展一项以不同来源,不同剂量n-3脂肪酸为干预物的为期12周的随机对照研究,从血脂、整合或掺入外周血单个核细胞膜脂肪酸构成的能力以及对其培养上清中炎症因子释放的影响三个层面对两种不同来源的n-3PUFA的生物学效价及有效作用剂量进行比较研究,本研究对于揭示不同来源及不同摄入水平n-3脂肪酸对心血管的健康效应的差异,论证ALA作为必需脂肪酸的营养学价值,以及从膳食和遗传方面阐明n-3脂肪酸健康效应人群差异的因为,具有重要的理论意义。
研究目的:
1、了解IL-6-572位点基因多态性对血脂的影响及其与红细胞膜n-3脂肪酸构成的交互作用,初步探讨炎症相关的遗传因素与环境因素共同作用在心血管疾病的发生发展中可能的效应。
2、确定不同来源n-3PUFA对轻中度血脂增高人群血脂、炎症细胞n-3脂肪酸构成及炎症相关心血管危险因素有益效应的作用剂量；阐明不同来源n-3脂肪酸影响血脂、炎症细胞脂质构成及其炎性因子表达的差异,为DRI的修订提供直接的科学依据。
研究内容与方法:
1.IL-6-572C>G基因多态性与血脂的关系及其与红细胞膜脂肪酸构成的交互作用的横断面研究
研究对象本研究为一项横断面调查,在广州市越秀区农林街和荔湾区人民街招募年龄40～65岁、符合条件的志愿者。研究对象纳入标准为:①年龄40～65岁；②无心绞痛、心肌梗死病史。③无侵入检查、治疗,脉管炎等急性炎症。④无肝、肾功能异常。⑤无既往高脂血症病史、糖尿病或糖耐量异常；⑥BMI<30kg/m2)。⑦无服用降脂药或其它影响血脂代谢的药物史(如阿司匹林、消炎痛、潘生丁等)。
膳食评价使用可量化的食物频数问卷(Food Frequency Questionaire,FFQ)调查研究对象过去1年的饮食情况。
指标检测标准方法检测身高、体重、血压等。Hitachi7600-010 automaticanalyzer检测血脂4项和血糖。采用北京天根生化科技有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒抽提基因组DNA,然后运用PCR-LDR技术检测IL-6-572位点基因多态性。气相色谱检测红细胞膜脂肪酸构成。
2.不同来源的n-3多不饱和脂肪酸对轻中度血脂增高人群血脂影响的随机、双盲、平行对照研究
研究对象纳入及分组在前述横断面研究中按以下标准征集志愿者150名。纳入标准为:①血脂轻中度增高(血TC:5.13～8.00mmol/L,血TC:0.8～3.4mmol/L):②性别不限；③年龄40～65岁；④BMI>23kg/m2；排除标准为:①慢性炎症性疾病,正在服用抗炎药物者；②服用降脂药物或其它影响血脂代谢的药物者。③冠心病、糖尿病或其他心血管相关疾病患者。
本研究为一项随机、双盲、平行设计干预试验,将合格的研究对象按区组随机方法分组,30人为一区组,共5个区组,每一区组按入选顺序随机分到对照组、低剂量鱼油组、高剂量鱼油组、低剂量亚麻籽油组、高剂量亚麻籽油组,共5组。以各组目标n-3PUFA摄入量作为组别代称,对照组、EPA/DHA1.8g组、EPA/DHA3.6g组、ALA4g组,ALA8g组。
干预物及干预目标本研究干预物为不同来源的n-3脂肪酸,包括植物来源的α-亚麻酸及来自鱼类的EPA/DHA。干预物加工成含油量1g的胶囊。包括3种,分别为对照油、鱼油及亚麻籽油胶囊。对照组及鱼油胶囊购自加拿大海洋营养公司,亚麻籽油胶囊为北京康惠中天科技有限公司馈赠。
为不过多增加受试者脂肪摄入量及达到双盲目的,干预胶囊定为每日6粒。低剂量组服用试验胶囊达到目标脂肪酸摄入量后,不足的胶囊数用对照胶囊补充,对服用6粒胶囊仍达不到干预目标的ALA8g组,通过烹调油补充到设计的目标值。项目设计了颜色、性状完全一致的两种烹调油。一种为不含n-3PUFA的玉米油,供对照组、EPA/DHA1.8g组、EPA/DHA3.6g组、ALA4g组食用。另一种为含亚麻籽油13.23％的玉米调和油,供ALA8g组食用,推荐烹调油摄入量28g/d,摄入28g/d玉米调和油可提供ALA3.7g,加上6粒胶囊提供的4.2gALA,达到8g/dALA的干预目标值。
干预实施为使研究对象脂肪酸摄入达到目标值并控制各组对象脂肪及n-3PUFA的摄入量,烹调油的发放按3口之家每月领2.5L的食用油一瓶,超过4人的家庭,于两周回访时加领一瓶。受试者干预期间所有外出吃饭用油均按普通调和油计算,外出吃饭每餐用油量按15g计算。干预期为12周。
盲法实施所有试验胶囊及对照胶囊的颜色、形状、气味包装均完全一致,标签统一采用“Omega-3胶囊,赠品”字样。干预用烹调油的颜色、形状、气味包装也完全一致,标签为“食用植物油,赠品”字样。由课题执行者上级进行分组,并对干预胶囊及烹调油进行编号和准备,干预期间,工作人员按入选编号派发即可。全部试验结束后,一级揭盲,进行分组分析,数据分析结束后二级揭盲。
随访在12周追踪期间,除进行随机电话访问及每周短信提醒外,每两周回访一次,随访内容包括,按所填写3天24小时膳食及体力活动问卷进行逐项核实；收回胶囊服用时间及缺服、补服签字记录表；收回使用完毕的包装盒及剩余胶囊。通过回收胶囊计数,胶囊服用记录吻合率,随机电话访问及每周短信提醒判断受试者依从性。回访发现回收胶囊数与胶囊服用记录不符的进行依从性教育。
指标检测常规方法检测研究对象0、12周身高、体重、血压等。Hitachi7600-010 automatic analyzer检测血脂4项和血糖,ELISA检测干预前后PBMCs培养上清中IL-6、TNF-α浓度,流式细胞技术检测干预前后外周血中分泌IL-6、TNF-α及IL-1β的CD14+细胞占全部CD14+细胞的百分比,气相色谱检测干预前后PBMCs脂肪酸构成,并随机抽取10％样品气质联用确认检到的脂肪酸种类。
结果:
1.横断面研究
对象一般情况共招募到739名志愿者,其中158名因资料不全排除分析,共有581名受试者进入横断面分析。在581名研究对象中,男性195人,平均年龄54.88岁,女性386人,平均年龄51.8岁。
红细胞膜脂肪酸本研究共检测到16种红细胞膜脂肪酸,约占红细胞膜总脂肪酸的90％。人群膳食ARA摄入量仅占总脂肪的0.02％,但在红细胞膜脂肪酸中约占13％,膳食DHA摄入量仅占总脂肪的0.02％,但在红细胞膜脂肪酸中约占8.5％。
IL-6-572位点基因分布情况研究对象IL-6-572位点基因分布符合哈迪-温伯格平衡,C等位基因的出现频率是0.786,G等位基因的出现频率是0.214。
IL-6-572位点多态性与血脂的关系没有发现IL-6-572位点基因多态性与人群血浆脂质水平有关。
IL-6-572位点多态性与n-3对血脂影响的交互作用研究对象进行红细胞膜n-3脂肪酸构成与IL-6-572位点基因多态性交互作用分析发现,当红细胞膜n-3PUFA构成处于下1/3水平时,携带G等位基因的男性HDL-c比CC纯合子高18％(p<0.05),apo A比CC纯合子高17％；随着红细胞膜n-3PUFA增高,携带G等位基因的男性HDL-c呈下降趋势,但差异没有显著性(p=0.087)；女性红细胞膜n-3PUFA构成与IL-6-572基因多态性没有交互作用,也未见红细胞膜其他脂肪酸构成与IL-6-572位点基因多态性有交互作。
2.随机对照试验
对象的一般情况从581名志愿者中征集到149名对象进入本次干预研究,其中有138人完成12周的干预试验,干预结束3人因自诉患痛风、系统性红斑狼疮、哮喘到医院就诊而被剔除。共有135名受试者纳入分析。其中,对照组26例,低剂量鱼油组28例,高剂量鱼油组28例,低剂量亚麻籽油组27例,高剂量亚麻籽油组26例,各组对象性别、年龄、教育水平、吸烟状况、家庭收入及每周外出就餐次数差异没有显著性。对6次3天24小时膳食问卷中膳食摄入量求平均,评价各组对象日常膳食及干预胶囊摄入情况,各组受试对象脂肪酸摄入量均达到预期目标值。
干预对血脂的影响经过12周的干预,EPA/DHA3.6g组TG较基线下降约17％,与对照组比较差异非常显著(p=0.012),EPA/DHA1.8g组TG较基线下降约10％,但与对照组比差异没有显著性(p>0.05),未发现两个ALA组TG有变化,与对照组比较差异没有显著性(p>0.05)。EPA/DHA1.8g组干预后HCL-c较基线上升约13％,ALA8g组干预后HDL-c上升6.5％,仅为EPA/DHA1.8g组的1/2,但与对照组比差异均没有显著性(p>0.05)。
干预对PBMCs脂肪酸构成的影响在受试者的PBMCs中共检测到16种脂肪酸,占所有PBMCs脂肪酸构成的约90％,其中构成比最高的五种分别是棕榈酸、硬脂酸、油酸、花生四烯酸和亚油酸。膳食总n-3PUFA、ALA、EPA、DHA摄入量占总脂肪摄入量的百分比与PBMCs对应脂肪酸构成呈正相关,r值分别为0.872,0.408,0.567和0.390,P均小于0.0001。干预后各组PBMCs饱和脂肪酸均下降,与对照组比较差异没有显著性(p=0.882);干预后总n-3PUFA、EPA及n-6/n-3比值变化组间差异均非常显著(p均小于0.001)；干预后两个鱼油组PBMCs脂肪酸中EPA构成比显著增高(p<0.001),EPA/DHA3.6g组增幅约为EPA/DHA1.8g组增幅的2倍。两个ALA组PBMCs脂肪酸ALA构成比增高,但与其他组比较差异没有显著性(p=0.070)。ALA4g组EPA构成增高(p<0.05),但仅为EPA/DHA1.8g组的1/5,未见ALA8g组EPA构成增加；干预后DHA变化组间没有差异(p=0.230),补充鱼油PBMCs脂肪酸中DHA的构成比较基线增高(p<0.05),但不呈剂量效应关系,补充ALAPBMCs脂肪酸DHA构成没有变化。
干预对炎症细胞因子表达的影响干预前后各组外周血分泌TNF-α、IL-6及IL-1β的CD14+细胞占所有CD14+细胞的百分比均没有差异。干预后EPA/DHA3.6g组对象PBMCs培养上清中IL-6水平与对照组比较差异有显著性(p=0.015),EPA/DHA3.6g组明显下降(p<0.05),对照组明显升高(p<0.05),未发现其他组干预前后有变化；干预后PBMCs分泌的,TNF-α组间变化差异没有显著性,除对照组外,其他各组均显著下降(p<0.05),重复测量的方差分析显示为时间效应,无时间与干预的交互作用；
结论:
1.IL-6-572位点多态性与体内红细胞膜n-3脂肪酸对血脂影响存在交互作用,当红细胞膜n-3PUFA构成较低时,男性G等位基因携带者HDL水平比CC纯合子高。
2.每天摄入1.85到3.66gEPA/DHA12周,能呈剂量效应性降低轻中度血脂增高人群的TG水平。增加ALA摄入量对该人群血脂没有影响。
3.每天摄入1.85到3.66gEPA/DHA12周EPA能呈剂量效应性掺入外周血单个核细胞,增加ALA摄入量没有此效应。
4.补充不同来源的n-3PUFA均不影响外周血CD14+细胞内IL-6、TNF-α、IL-1β的表达,摄入3.66gEPA/DHA12周可使外周血单个核细胞IL-6的释放减少,推测EPA/DHA通过影响IL-6出胞过程而改变其释放的。
α-亚麻酸;血脂异常;白细胞介素6;肿瘤坏死因子-α;细胞内细胞因子染色;心血管疾病
中山大学
博士
营养与食品卫生学
苏宜香
2010
中文
R446.11;R54
2011-08-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）