应用基因组改组技术选育广域pH耐受的谷氨酸高产菌株
谷氨酸是一种典型的传统大宗发酵产品,在其发酵控制中,pH是一项重要参数。筛选广域pH耐受的谷氨酸高产菌株,有利于在实际生产中减少液氨和浓硫酸用量,降低生产过程中粗放操作对发酵产量造成的影响。本文利用基因组改组技术选育广域pH耐受的谷氨酸高产菌,经过2轮改组,得到了4株优良菌,并通过扩增片段长度多态性(AFLP)对改组菌与原始菌进行了DNA多态性分析。
本课题首先考察了实验室保藏的九株谷氨酸生产菌的pH耐受性和发酵特性。其中SW07-01、SW07-02和T613-85,在低pH条件下表现出明显的生长优势;SW07-01、SW07-03和T613-85具有较强的高pH耐受能力;发酵产酸量最高的是SW07-01和SW07-06。因此,SW07-01确定为基因组改组的原始出发菌。
本文建立了一套基于细胞培养板的通量筛选方法:首先通过极端pH平板进行预筛,挑选耐受性较强的单菌落至含有。pH指示剂的发酵培养基平板培养,将产生变色圈的菌株接种至细胞培养板发酵初筛,挑选产酸大于原始菌产量95％的突变菌株进行摇瓶发酵复筛,产量大于原始菌的即为筛得菌株。
SW07-01培养至对数中前期(约5 h),对其进行X射线诱变及DES诱变。利用建立的筛选方法筛选得到7株优良菌株,其中低pH耐受性提高的四株菌:D-D-2-2、D-D-2-3、D-D-2-17、X-D-8和高pH耐受性提高的三株案例菌:D-G-6-13、D-G-6-32、D-G-7-2。以上述七株诱变菌株为母本进行第一轮基因组改组,得到了三株pH耐受性有所提高并且产酸优于原始菌的F1代改组菌F1-1-1、F1-1-4和F1-2-2。再以F1代改组菌为母本进行第二轮改组,筛选得到了F2-1-17、F2-2-7、F2-8-18、F2-9-11四株广域pH耐受的谷氨酸高产菌株。
对F2代改组菌、F1代改组菌、诱变菌和原始菌的pH适应性及发酵特性进行了比较。原始菌的耐受pH范围为5.0-10.8,经过诱变和改组,菌株的pH耐受性得到提高,其中F1代菌株中,低pH耐受可至4.8,高pH最高可至11.2;F2代菌株中最大pH耐受范围是4.6.11.4。摇瓶中F2代改组菌平均产酸较原始菌提高了76.7％,其中最高的:F2-2-7提高了93.3％,5 L搅拌发酵罐中,F2代平均产酸较原始菌平均提高23.0％,其中F2-2-7发酵36h,谷氨酸产量106 g/L,较原始菌提高了68.3％。
并且,采用扩增片段长度多态性(AFLP)方法比较了F2代改组菌和原始出发菌的DNA多态性,聚类分析结果表明F2-2-7与SW07-01的遗传相似系数为0.93,反映了两者在基因组上存在差异。
江南大学
硕士
生物化工
孙志浩;倪晔
2010
中文
TQ922.1;TQ920.1
2011-06-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）