禽流感病毒H9N2亚型毒株的分离与鉴定及其浓缩灭活苗的研制与推广应用
禽流感（Avian Influenza，AI）是由A型流感病毒引起的禽类一种病毒性传染病。禽流感病毒血清型众多。禽流感引起的疾病的危害程度取决于多种因素，包括感染病毒的毒力、鸡体的免疫状态，营养状况以及应激状态、继发的细菌感染等。禽流感的症状包括产蛋下降到急性致死。我们国家对消除禽流感疾病的决策是（a）对感染鸡或可疑感染鸡进行扑杀、销毁以消除传染源。（b）采取疫苗免疫的预防措施。
高致病性和低致病性的禽流感目前在我国都有发生。H9N2亚型的禽流感病毒属于低致病性，一般不引起鸡的死亡，但可引起产蛋鸡产蛋率的急剧下降，给养殖业带来严重的经济损失。2000年底我们从山东产蛋下降鸡群中分离到到不同禽流感毒株，经山东农业大学禽病防制技术工程中心和国家流感中心鉴定为H9N2亚型的禽流感病毒。我们进行了有效疫苗的相关研究。
1.病毒的分离与鉴定：H9N2 AIV是从产蛋下降的鸡群中分离而得到。经鉴定，该病毒具有血凝活性，其血凝性不能被新城疫、传染性支气管炎、H5亚型的禽流感病毒和减蛋综和症的阳性血清所中和，但可被H9N2亚型的禽流感病毒所中和。表明该分离毒株是H9N2亚型的禽流感病毒。生物学特性分析表明该毒株平均死亡时间（MDT/MLT）为80.6小时；对1日龄雏鸡的脑内致病指数（ICPI）为0.06，对6周龄雏鸡静脉致病指数（IVPI）为0；病毒血凝解脱（NHAT）为快速；血凝素56℃不稳定。上述结果表明，此分离毒株为低致病性的3其生物学特性表明该毒株为低致病性的H9N2亚型禽流感病毒。纯化的病毒经国家流感中心鉴定进一步证实该病毒为低致病力的禽流感V-H9N2。命名为A/Chicken/Shandong/2000/LG1（H9N2）），简称H9N2AIV。
2.将最初分离的H9N2 AIV进行了传代稳定性和免疫学特性进行分析。用SPF鸡胚连续传至15代。研究结果表明传至10代后，鸡胚病变明显，该病毒的免疫原性，HA效价、EID50均稳定，HA效价为9Log2，EID50/0.1ml为10-7.4。为避免病毒在连续传代的过程中发生抗原漂移，我们选择第10～15代毒作为基础毒种。
3.本试验以分离毒株H9N2 AIV研制了浓缩油乳剂疫苗。影响尿囊液病毒滴度的因素研究表明，种毒做103倍稀释时，收获尿囊液的病毒滴度最高。鸡胚日龄以10日龄鸡胚收获毒液最佳。甲醛对收获的毒液灭活效果表明，H9N2AIV尿囊液用0.2％甲醛浓度48小时可以完全灭活。
4.在安全试验中浓缩疫苗以正常使用剂量的4倍，肌肉注射28日龄SPF鸡；5日龄SPF雏鸡经皮下注射接种0.3ml疫苗；28日龄SPF鸡，在3周内连续免疫2次：以使用剂量（0.5ml/羽）注射高产期蛋鸡，鸡群饮食欲均正常，无不良反应，说明该疫苗对鸡是安全的。
5.经疫苗的最小免疫剂量试验证明，接种0.2ml/羽份，疫苗可以达到理想的免疫效果，为了在使用过程中保险起见，推荐最小接种剂量为0.3ml/羽份。
6.疫苗在鸡体内抗体动态的观察：经过抗体反应试验证明，普通未浓缩的油乳苗，注射0.5ml后，2周时仍有部分个体不产生抗体，4周内抗H9N2抗体HI滴度不仅平均低，而且不均匀，个体间差异比较大，难以达到理想的预防效果。而浓缩疫苗在2周时，已均匀出现抗体，4周时抗H9N2抗体HI滴度达到高峰，分别为达到9 Log2以上以上。
通过抗体反应试验证明，浓缩疫苗在免疫后40天抗体开始下降，到100天时，已经达到保护的边缘。
通过二次免疫抗体动态观察试验表明，二次免疫后产生的抗体持续时间长，足以保护蛋鸡的整个产蛋期。
7.田间试验与区域试验表明，禽流感浓缩疫苗在使用过程中，在鸡体内产生的抗体能有效的保护鸡群免受禽流感病毒的袭击。
7.推广应用：该产品于2002年7月拿到农业部新兽药证书后，我们对该疫苗进行了大量的推广应用，取得了良好的社会效益和经济效益。
南京农业大学
博士
兽医
陈溥言
2005
中文
S852.65;Q93-331
2011-06-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）