益气养阴活血法对糖尿病大鼠不同时期肾脏组织bax和bcl-2表达的影响
目的：糖尿病肾病( Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常见的严重微血管并发症之一，也是导致终末期肾病及糖尿病患者死亡的主要原因，因此，有效防治DN的发生和发展具有重要意义。本研究通过腹腔注射STZ法建立糖尿病大鼠模型，之后应用益气养阴活血(Tonify-qi andnourish-yin, promote blood circulation, TNPC)法对该模型进行干预，通过观察血糖(Glucose,GLU)，总胆固醇(Total cholesterol,TC)，甘油三脂(Triglyceride,TG),24小时尿白蛋白排泄率(Urinary albumin excretionrate,UAER)，血尿素氮（BUN）、肌酐清除率(Ccr)，肾脏病理形态学变化以及肾组织中bax与bcl-2的水平，研究该法对DN的防治作用及其可能机制，为其临床应用提供实验基础与理论依据。
方法：选用清洁级健康雄性Wistar大鼠50只，体重200g±10g，普通饲料适应喂养一周，检测尿糖和尿蛋白均为阴性，空腹12小时后，随机取38只造模，将新制成的1％的链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)溶液，按55mg/kg腹腔注射，剩余的12只为正常对照组(The Normal ControlGroup,NCG)，注射同量的0.1mmol/L枸橼酸缓冲液。72小时后，分三日分别测38只模型大鼠随机血糖三次，当其中有两次血糖≥16.7mmol/L时，确认糖尿病大鼠造模型成功，随机分为糖尿病模型组(Model Group，MG)，厄贝沙坦治疗组(Irbesartan Group，IBG)，中药治疗组(Chinese MedicineTreatment Group,CMG)，各12只。各治疗组(Treatment Group)在造模成功一周后开始按成人剂量的10倍给药，每日一次。中药组给予益气养阴活血方，按32g/(kg·d)灌胃，厄贝沙坦组给予厄贝沙坦片按25mg/(kg·d)灌胃，正常组和模型组均以相应量的生理盐水灌胃。给药8周(8 weeks，8w)后从四组中各随机取6只处死，其余6只12周(12 weeks,12w)后处死。处死前一天将大鼠置于代谢笼，收集24小时尿液，记尿总量，并测尿白蛋白排泄率，尿肌酐。12小时禁食水，称体重（Body Weight,BW），断尾测血糖，以2％戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，经股动脉取血，分别测总胆固醇、甘油三脂、血尿素氮(BUN)、肌酐清除率(Ccr)。处死动物，取出右侧肾脏，去掉被膜，滤纸吸干血迹后称重，记录肾重（Kidney Weight，KW）并计算肥大指数（肾重/体重，KW/BW）；取部分肾组织于4％多聚甲醛中固定，用于常规病理观察及免疫组织化学检测bax、bcl-2的表达，并用病理图像分析软件进行半定量分析。
结果：
1实验大鼠的一般状况
正常组大鼠饮食正常，精神状态好，反应敏捷，尿量正常，体重明显增加。其余三组注射STZ后，均出现明显的多饮、多食、多尿症状，并慢慢出现精神萎靡、反应迟钝、少动、皮毛无光泽、体型瘦小。12周时上述表现较8周时明显，其中以模型组最为显著。在注射STZ后3～5天，造模组有2只大鼠死亡，死亡原因可能为高血糖引起代谢紊乱，最终导致脏器衰竭。
2各组大鼠24小时尿白蛋白排泄率
8周和12周时，糖尿病组大鼠24小时尿白蛋白排泄率，较同期对照组比较均有明显升高，有统计学意义(p＜0.01、p＜0.05)。厄贝沙坦组、中药组比模型组低，有统计学意义(p＜0.05)。厄贝沙坦组与中药组之间，无统计学意义(p＞0.05)。糖尿病组12周与8周比较，变化不明显，无统计学意义(p＞0.05)。
3各组血糖、总胆固醇、甘油三脂
8周和12周时糖尿病组大鼠血糖、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)较同期对照组大鼠明显增加，均有统计学意义(p＜0.05)。厄贝沙坦组、中药组与模型组相比有差异(p＜0.05)，厄贝沙坦组与中药组比较无统计学意义(p＞0.05)。12周与8周比较，各治疗组血糖、TC和TG均有所降低，无统计学意义(p＞0.05)。
4各组大鼠肾功能（BUN、肌酐清除率）
8周和12周时，糖尿病组大鼠血尿素氮升高和肌酐清除率的降低，较同期对照组均有统计学意义(p＜0.01)。在厄贝沙坦组与中药组，血尿素氮比模型组低，肌酐清除率比模型组高，均有统计学意义(p＜0.01)。厄贝沙坦组与中药组比较无差别(p＞0.05)。12周与8周比较，各治疗组血尿素氮降低，肌酐清除率增加，无统计学意义(p＞0.05)。
5各组大鼠体重、右肾重、肥大指数( KW/BW)
8周和12周时，糖尿病组大鼠体重下降、右肾重和肥大指数增加，较同期对照组有统计学意义(p＜0.05)。厄贝沙坦组和中药组较模型组变化明显，有统计学意义(p＜0.05)。厄贝沙坦组和中药组之间，无差别(p＞0.05)。12周与8周比较，模型组、厄贝沙坦组和中药组，体重、右肾重变化有统计学意义(p＜0.05)；肥大指数变化，均无意义(p＞0.05)。
6肾脏病理形态光镜观察
常规病理学观察：光镜下观察，HE和Masson染色，糖尿病组大鼠较对照组肾小球体积增大，系膜基质增多，系膜细胞轻度增生，部分肾小管上皮细胞发生空泡变性。12周时，还可见部分肾小管萎缩，部分扩张，透明管型形成，肾小球及肾小管基底膜增厚，基质增宽，纤维组织增生，球囊粘连。
7免疫组织化学检测bax、bcl-2表达
7.1光镜下观察
Bax在肾组织中的表达：正常对照组表达于肾小球的足细胞、近曲小管、远曲小管、集合管等上皮细胞胞浆中；糖尿病组，在足细胞增加，远曲小管及小管间质细胞明显增加，8周时治疗组较模型组在近曲小管及远曲小管的表达减少，12周时在远曲小管各段明显减少。
Bcl-2在对照组主要表达于近曲小管各段和皮髓交界处，远曲小管和集合管有少许表达；糖尿病组，在部分近曲小管明显减少，而部分近曲小管的表达未见明显变化。8周时治疗组较模型组，在近曲小管近段略有增加，在远端小管明显增加；12周时在近曲小管表达呈明显强阳性，皮髓交界处表达较高。
7.2病理图象半定量分析：
8周和12周时，与正常对照组比较，bax的表达在模型组(P＜0.01)、厄贝沙坦组(P＜0.05)、中药组(P＜0.05)肾组织内的水平均明显增加；厄贝沙坦组与中药组明显低于模型组(P＜0.01)；中药组和厄贝沙坦组之间无明显差别(P＞0.05)。12周与8周比较，模型组增加(P＜0.05)，中药组、厄贝沙坦组减少(P＜0.01)，正常组无统计学意义(P＞0.05)。
8周和12周时bcl-2的表达在模型组、厄贝沙坦组、中药组表达均明显增加(P＜0.05)；厄贝沙坦组与中药组高于模型组(P＜0.01)，中药组和厄贝沙坦组之间无明显差别(P＞0.05)。12周与8周比较，模型组减少(P＜0.01)、中药组和厄贝沙坦组增加(P＜0.05)，正常组变化无统计学意义(P＞0.05)。
8周和12周时，Bax/Bcl-2，在模型组、中药组和厄贝沙坦组较正常组高，均有统计学意义(P＜0.05)。中药组、厄贝沙坦组较模型组低(P＜0.05)，中药组与厄贝沙坦之间无差别(P＞0.05)。12周与8周比较，Bax/Bcl-2在正常组(P＞0.05)、模型组(P＞0.05)无差别。中药组和厄贝沙坦组的降低，有统计学意义(P＜0.01)。
结论：
1益气养阴活血中药可以降低糖尿病肾病大鼠的血糖，总胆固醇，甘油三酯。
2益气养阴活血中药可以减少糖尿病肾病大鼠的尿蛋白，降低血尿素氮，提高肌酐清除率，保护肾功能。
3益气养阴活血中药可以有效抑制糖尿病肾病大鼠的肾小球毛细血管基底膜的增厚、系膜基质的增生，延缓肾脏病理的进展。
4益气养阴活血中药可以有效地上调bcl-2表达，降低bax表达，从而降低bax/bcl-2，减少肾组织的细胞凋亡，从而保护肾脏结构的完整和功能的稳定，且随着疗程的增加，这一作用趋势可能更加显著，为防治糖尿病肾病提供新的思路。
河北医科大学
硕士
中医内科学
张庚良
2010
中文
R587.2;R242
62
2011-02-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）