大蒜油拮抗酒精性肝损伤及相关机制的研究
研究目的
本研究采用一次经口给予雄性昆明小鼠4.8 g/kg bw乙醇建立急性酒精性肝损伤模型,通过测定血清和肝脏生化指标以及肝脏病理改变,评价大蒜油拮抗急性酒精性肝损伤的效果；并从机体抗氧化系统、线粒体功能、肝脏乙醇代谢酶系以及脂肪代谢等方面探讨大蒜油拮抗急性酒精性肝损伤的机理。最后,采用人正常肝细胞建立体外损伤模型,观察大蒜油对乙醇损伤LO2细胞的保护作用。
研究方法
1.健康雄性昆明小鼠随机分为3个大组,分别给予30 d、7 d和1次大蒜油或等体积玉米油处理后,一次性经口给予4.8 g/kg bw乙醇诱导急性酒精性肝损伤,测定血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性、肝体比值和肝脏甘油三酯含量以及病理学改变,评价大蒜油拮抗急性酒精性肝损伤的效果。
2.称取适量肝组织,制备10％肝组织匀浆,利用试剂盒测定肝匀浆中丙二醛和还原性谷胱甘肽的含量,以及超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽S-转移酶的活性,反映机体抗氧化系统的改变。
3.差速离心法制备线粒体,测定线粒体膜电位和肿胀度来反映线粒体的功能；测定线粒体悬液中MDA和GSH含量,以及Mn-SOD和GPx的活性,来反映线粒体抗氧化体系功能。
4.制备10％肝组织匀浆,测定乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性,评价大蒜油对ADH和ALDH活性的影响。
5.超速离心法制备微粒体,测定细胞色素P4502E1、1A2、3A的活性和蛋白表达；RT-PCR法测定CYP2E1的mRNA水平。
6.测定胞浆中乳酸/丙酮酸的比值,反映NAD+/NADH的比值；ELISA法测定血清中极低密度脂蛋白水平,反映脂肪外输；测定血清游离脂肪酸含量,反映外周脂肪动员；测定肝脏中磷酸化的.AMP依赖的蛋白激酶、磷酸化的乙酰辅酶A羧化酶、过氧化物酶体增殖物激活受体-α、甾醇调节元件结合蛋白-1以及脂肪酸合成酶的蛋白水平和肝脏中FFA以及血清中脂联素和肿瘤坏死因子-α的含量的动态变化,探讨大蒜油拮抗急性酒精性脂肪肝的分子机制。
7.培养人正常肝细胞,建立酒精损伤细胞模型,测定细胞培养液中ALT和AST的活性,细胞中MDA、GSH和TG含量,以及细胞中CYP2El和Caspase-3的蛋白表达,评价大蒜油拮抗乙醇所致的LO2细胞损伤的效果。
研究结果
1.大蒜油拮抗急性酒精性肝损伤的效果评价
1.1提前给予30 d大蒜油有效的拮抗了急性酒精性肝损伤
肝脏冰冻切片苏丹Ⅲ染色结果显示,对照组未见脂滴,模型组有大量的橙黄色脂滴蓄积,三个剂量大蒜油组脂滴明显减少变小。
1.2提前给予7 d大蒜油有效的拮抗了急性酒精性肝损伤
病理学检查可见,大蒜油各组肝脏切片橙黄色脂滴明显减少变小。
1.3提前2 h给予1次大蒜油有效的拮抗了急性酒精性肝损伤
病理学检查显示,大蒜油组肝脏切片橙黄色脂滴明显减少变小。
1.4不同时间给予大蒜油拮抗急性酒精性肝损伤的效果比较
病理学检查显示,大蒜油提前给予组和与乙醇同时给予组小鼠肝脏脂肪变性明显减轻:大蒜油延后给予组脂滴较模型组略有减少。
2.大蒜油对小鼠肝脏抗氧化系统的影响
2.1提前给予30 d大蒜油提高了机体的抗氧化能力
与模型组相比,高剂量大蒜油组小鼠肝匀浆SOD、GR、CAT的活性分别升高了27.51％、33.57％和18.58％。
2.2提前给予7 d大蒜油提高了机体的抗氧化能力
2.3提前2 h给予1次大蒜油提高了机体的抗氧化能力
2.4提前2h给予1次大蒜油对线粒体功能和线粒体抗氧化系统的影响
与对照组相比,模型组小鼠肝细胞线粒体A540nm降幅在8、16 h时间点分别增加了45.70％和42.47％(P<0.01)；提前给予大蒜油各组小鼠5 min内A540nm降幅较模型组均显著降低。
3.大蒜油对小鼠肝脏乙醇代谢酶系的影响
3.1大蒜油对小鼠肝脏ADH和ALDH活性的影响
大蒜油对小鼠肝细胞胞浆中ADH和ALDH的活性无显著影响。
3.2大蒜油对小鼠肝脏CYP2EI活性、蛋白和mRNA水平的影响
3.3大蒜油对小鼠肝脏CYP1A2活性和蛋白水平的影响
3.4大蒜油对小鼠肝脏CYP3A活性和蛋白水平的影响
大蒜油和乙醇对小鼠肝脏CYP3A的活性无显著影响。
4.大蒜油对小鼠急性酒精性脂肪肝各因素的影响
4.1大蒜油对血清中VLDL含量的影响
大蒜油和乙醇对小鼠血清中VLDL含量均无显著影响。
4.2大蒜油对乙醇所致的NAD+/NADH的比值的影响
4.3大蒜油对血清和肝脏中FFA水平的影响
与对照组相比,模型组小鼠血清FFA水平在16 h时间点增加了17.91％(P<0.01)。与模型组相比,低中高剂量大蒜油组小鼠血清FFA水平分别下降了19.69％、31.76％和29.08％(P<0.01)。
4.5大蒜油对小鼠肝脏mature SREBP-1、PPAR-α、p-AMPK、p-ACC、FAS蛋白水平的影响
与对照组相比,模型组小鼠肝脏mSREBP-1蛋白水平在8、16 h两个时间点分别增加了24.39％和10.91％(P<0.05或P<0.01)。与模型组相比,低中高剂量大蒜油组小鼠肝脏mSREBP-1蛋白水平在8 h时间点分别降低了34.28％、45.41％和53.53％(P<0.01),在16 h时间点分别降低16.99％、29.52％和47.76％(P<0.01)。
与对照组相比,模型组小鼠肝脏PPAR-α的蛋白水平在4、8 h时间点分别降低了27.13％和51.14％(P<0.01)。与模型组相比,低中高剂量大蒜油组小鼠肝脏PPAR-α蛋白水平在4 h时间点分别增加了78.83％、105.45％和120.04％(P<0.01),在16 h时间点分别增加了69.52％、62.66％和70.22％(P<0.01)。
与对照组相比,模型组小鼠肝脏P.AMPK蛋白水平在8 h时间点增加46.70％(P<0.01)。与模型组相比,低中高剂量大蒜油组小鼠肝脏P-AMPK的蛋白水平在4 h时间点分别增加了26.97％、56.31％和86.89％(P<0.05或<0.01)。在8 h时间点,低中高剂量大蒜油组小鼠肝脏p-AMPK的蛋白水平亦高于对照组,但低于模型组。在16 h时间点,各组小鼠肝脏p-AMPK的蛋白水平无显著差异(P>0.05)。
与对照组相比,模型组小鼠肝脏P-ACC蛋白水平在4 h时间点下降了17.65％(P<0.01),在8 h时间点增加了80.91％(P<0.01)。与模型组相比,低中高剂量大蒜油组小鼠肝脏P-ACC的蛋白水平在4 h时间点分别增加了32.48％、19.64％和47.89％(P<0.05或P<0.01)。在8 h时间点,大蒜油组小鼠肝脏P-ACC蛋白水平较对照组亦显著增加(P<0.05),但低于模型组水平。在16 h时间点,各组别小鼠肝脏中p-ACC蛋白的水平无显著的统计学差异(P>0.05)。
与对照组相比,模型组小鼠肝脏FAS的蛋白水平在8 h时间点增加了12.93％(P<0.05)；低中高剂量大蒜油组小鼠肝脏FAS的蛋白水平在4 h时间点分别降低了40.00％、53.45％和70.06％(P<0.01),在8 h时间点分别降低了36.87％、47.55％和66.83％(P<0.01),在16 h时间点分别降低10.62％、35.59％和52.12％(P<0.01)。
5.大蒜油对乙醇损伤LO2细胞的影响
5.1大蒜油对LO2细胞培养液中转氨酶活性和TG含量的影响
大蒜油显著抑制了100 mM的乙醇所致LO2细胞培养液中转氨酶活性和TG含量的升高。
5.2大蒜油对LO2细胞中MDA和GSH含量的影响
5.3大蒜油对LO2细胞中脂肪含量的影响
油红O染色结果显示,乙醇组LO2细胞中可见较多的红色的脂肪着色；对照组和大蒜油组未见明显的脂肪着色:大蒜油和乙醇共处理组脂肪变性程度较乙醇组明显减轻。
5.4大蒜油对LO2细胞中CYP2E1和Caspase-3蛋白含量的影响
结论
1.一定剂量的大蒜油可有效拮抗4.8 g/kg bw乙醇所致小鼠急性肝损伤和100mM乙醇所致的LO2细胞损伤。
2.大蒜油可通过提高机体抗氧化能力抵抗急性酒精所致的氧化应激,维持线粒体的正常功能；抗氧化活性是大蒜油发挥拮抗急性酒精性肝损伤的机制之一。
3.大蒜油拮抗急性酒精性肝损伤的作用可能与其显著抑制CYP2E1的活性和蛋白水平有关。
4.大蒜油拮抗急性酒精所致的肝脏脂肪蓄积,可能与其增强了脂肪酸的氧化代谢和减少脂肪酸的合成有关。
5.一定剂量的大蒜油对CYP2E1和1A2的抑制作用会随着给予时间的延长而逐渐减弱。
6.一定剂量的大蒜油对CYP3A无显著影响。
山东大学
博士
卫生毒理学
谢克勤
2010
中文
R575.5;R285
183
2011-02-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）