砷对人脐静脉内皮细胞损伤及硒干预作用的研究
目的：
研究不同浓度砷对体外培养人脐静脉血管内皮细胞的损伤作用;不同浓度硒对体外培养人脐静脉血管内皮细胞生长的影响;适宜浓度的硒对不同浓度砷造成的血管内皮细胞损伤的拮抗作用。
方法
人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)置于37℃,5％CO2,饱和湿度条件下培养。细胞处于对数生长期时进行实验。实验分组:加砷组、加硒组和加砷加硒组。加硒组硒(Se)浓度分别为0.05、0.1、0.5、1、2μmol/L。加砷组和加砷加硒组砷(As)浓度分别为0.05、0.1、0.5、1.5、3、6、12μmol/L,加砷加硒组硒浓度为0.1μmol/L,每组均设空白对照作为对照组。连续培养48h后收集细胞培养液与细胞待用。采用四唑盐(Methyl thiazolyltetrazolium,MTT)比色法测定细胞活性;瑞氏-吉姆萨染色(Wrigh-Giemastaining)观测细胞形态,吖啶橙荧光染色(Acridine orang staining)测定细胞凋亡的情况。检测培养液中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-px)活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量。检测培养细胞培养液中内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及诱导型一氧化氮合酶(Induciblenitric oxide synthase,iNOS)活性。采用酶联免疫吸附试验(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)检测培养液中细胞间粘附分子-1(Intercellular celladhesion molecule-1,ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(Vasular cell adhesionmolecule-1,VCAM-1)的表达情况。采用逆转录聚合酶链反应(Reversetranscription polymersade chain reaction,RT-PCR)测定eNOSmRNA、iNOSmRNA表达水平。多组间比较采用方差分析,两两比较采用q检验。
结果
1砷对血管内皮细胞损伤作用
1.1细胞形态学观察
瑞氏-吉姆萨染色发现加砷组血管内皮细胞的数量随着浓度的增大而减少,内皮细胞收缩变形,细胞间隙增大,随着浓度的升高,细胞膜损伤,细胞核固缩。出现“裸核”现象,甚至可见网状的染色质结构。吖啶橙染色细胞核变形明显,聚集在细胞边缘,荧光碎片增多。
1.2砷对细胞生长的影响
加砷组与对照组相比,砷浓度为0.05μmol/L时,细胞生长正常(P＞0.05)。砷浓度为0.1μmol/L时明显抑制细胞的生长(P＜0.01),抑制作用随着培养液中砷浓度的增大而增强。
1.3砷对培养液中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响
砷浓度为0.05μmol/L时,SOD、GSH-pX活性和MDA含量均无显著变化(P＞0.05),砷浓度为0.5μmol/L时,培养液中MDA含量明显增加(P＜0.05)。随着砷浓度的升高,SOD、GSH-pX活性下降,MDA含量增加(P＜0.01)。
1.4砷对培养液中NOS活性及细胞NOSmRNA表达水平的影响
砷浓度为0.05、0.1μmol/L时,对NOS活性及NOS mRNA表达无影响,(P＞0.05),随着砷浓度增大eNOS活性及eNOS mRNA表达水平逐渐减弱(P＜0.01),iNOS活性和iNOSmRNA表达水平则逐渐增强(P＜0.05或P＜0.01)。
1.5砷对培养液中ICAM-1和VCAM-1表达的影响
砷浓度为0.05、0.1μmol/L时,对培养液中ICAM-1和VCAM-1表达无影响(P＞0.05);随着砷浓度的增大,两种CAM表达水平逐渐增高,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。
2硒对血管内皮细胞的影响
通过研究硒对内皮细胞形态、细胞活性、培养液中SOD、GSH-px活性和MDA含量、内皮细胞NOS活性和NOSmRNA表达、内皮细胞的ICAM-1和VCAM-1表达的影响,0.1μmol/L硒对细胞生长无任何不良影响且有一定的积极作用,从而确定硒的干预剂量为0.1μmol/L。
3硒对砷造成血管内皮细胞损伤的干预作用
3.1硒对砷造成细胞形态改变的影响
培养液中加入不同浓度砷和0.1μmol/L硒培养细胞48 h后细胞染色观察,砷浓度0.05、0.1μmol/L细胞形态正常;随着砷浓度的增加,细胞形态逐渐不规则,细胞膜损伤加重,凋亡细胞增多。吖啶橙染色可见形荧光碎片增多。
3.2不同浓度砷和适量硒对细胞活性的影响
培养液中加入不同浓度砷和0.1μmol/L硒培养细胞48 h后,MTT测定细胞活性,结果显示,与同剂量加砷组相比,在砷的浓度为0.1、0.5μmol/L时,细胞增殖率升高,(P＜0.05)。随着砷浓度的增大,与加砷组比较,各组细胞增殖率均有所升高,但差异无统计学意义(P＞0.05)
3.3不同浓度砷和适量硒对细胞培养液中SOD、GSH-PX活性和MDA含量的影响
培养液中加入不同浓度砷和0.1μmol/L硒培养细胞48 h后,与同剂量加砷组相比,培养液中SOD在砷浓度为0.05、0.5μmol/L,GSH-px在砷浓度为0.05、0.1μmol/L时,活性均有所升高(P＜0.05)。培养液中MDA含量在砷浓度为0.05、0.1μmol/L时有所下降,差异有统计学意义(P＜0.05)。
3.4不同浓度砷和适量硒对细胞培养液中NOS活性和细胞NOSmRNA表达的影响
培养液中加入不同浓度砷和0.1μmol/L硒培养细胞48 h后,与同剂量加砷组相比,砷浓度为0.05、0.1、0.5μmol/L时,eNOS活性升高(P＜0.05),砷浓度为0.05、0.1μmol/L时,iNOS活性降低(P＜0.05)。RT-PCR测定结果显示,砷浓度为0.05、0.5、1.5μmol/L时,加砷加硒组eNOS mRNA含量升高(P＜0.05),砷浓度为0.05、0.1、1.5μmol/L,时,加砷加硒组iNOS mRNA含量有所下降(P＜0.05)
3.5不同浓度砷和适量硒对内皮细胞粘附分子表达的影响
培养液中加入不同浓度砷和0.1μmol/L硒培养细胞48 h后,与同剂量加砷组相比,砷浓度为0.05、0.1μmol/L时,加砷加硒组细胞培养液中ICAM-1和VCAM-1含量降低(P＜0.05),随着砷浓度增大,细胞培养液中ICAM-1和VCAM-1虽有不同程度降低,但差异无统计学意义(P＞0.05)。
结论
1、砷可以使内皮细胞形态发生改变,并且导致细胞的调亡;适量硒可拮抗砷对细胞的损伤。
2、砷可使培养液中的SOD、GSH-Px活性降低,MDA含量增高;适量硒可改善这种现象,使SOD、GSH-Px活性明显升高,MDA含量下降。
3、砷可抑制内皮细胞eNOS mRNA的表达,使培养液中eNOS活性降低;刺激iNOS mRNA的表达,使培养液中iNOS活性增强;适量硒可以改善砷对细胞NOS mRNA的影响,使eNOS和iNOS活性趋于正常。
4、砷可刺激内皮细胞粘附分子的表达,使培养液中ICAM-1和VCAM-1的表达水平增高;在砷的浓度较低时,适量硒可以改善砷对细胞粘附分子的影响,使其浓度与同剂量加砷组相比有所下降。
山东大学
硕士
营养与食品卫生学
蔺新英;边建朝
2010
中文
R995;R151.3
71
2010-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）