基因敲除鼠的建立及其表型的初步分析
线粒体通过氧化磷酸化(OXPHOS)生成ATP,为基本生命活动提供能量。线粒体嵴上承载着OXPHOS呼吸链复合物,嵴结构的复杂程度与能量需求成正比,在能量需求高的组织,线粒体嵴也很丰富。线粒体内膜的形态随着代谢状态不同而发生变化(Mannella,2006)。因此我们推测控制嵴形态的分子具有调节线粒体OXPHOS功能。Inner Membrane Protein of Mitochondria(IMMT),又称Mitofilin,是定位在线粒体内膜上,控制嵴结构的蛋白分子(John et al.,2005),为进一步在整体动物水平探讨IMMT生理功能,有必要建立Immt敲除鼠。
我们通过囊胚注射,将Immt突变的胚胎干细胞(ES)注入到受体胚胎中,得到进入种系的嵌合体而产生.Immt缺失杂合子(Immt+/-)。通过5’RACE和PCR实验验证,基因诱捕载体整合至Immt基因的第三内含子中,Immt+/-小鼠杂交后出生的346只子鼠中,没有Immt缺失纯合子(Immt-/-),只有Immt+/+和Immt+/-小鼠,其比例为1:2,结合孟德尔规律推测,Immt完全缺失鼠未出生。
我们分析了Immt+/-小鼠杂交后不同时间的胚胎,来研究Immt-/-小鼠是否存在胚胎致死及胚胎致死阶段。结果证明,Immt-/-小鼠可以顺利经过囊胚阶段并着床进入原肠胚期。同窝.Immt+/-和Imm+/+小鼠已发育至9.5天胚胎(E9.5)形态,而Immt-/-小鼠还停留在E7.5天形态,明显的形体小,发育迟缓,Immt-/-小鼠没有可见的心脏结构和神经管闭合。BrdU掺入实验证明Immt-/-小鼠在E8.5天仍有增殖;TUNEL实验结果表明.Immt-/-胚胎细胞在E9.5天凋亡旺盛,逐渐吸收。
透射电镜超微结构显示,E7.5、E8.5、E9.5 Immt-/-胚胎线粒体嵴紊乱,肿胀,部分空化缺失。Immt-/-胚胎酶组织化学和Immt+/-小鼠肝脏体外线粒体复合物酶活性检测,共同证明IMMT缺失导致线粒体OXPHOS电子传递链末端复合物,即细胞色素c氧化酶(COX)活性明显降低,而琥珀酸脱氢酶(SDH)和ATP酶(ATPase)活性没有观察到明显变化。Immt+/-MEF线粒体膜电位上升,活性氧(ROS)生成增多。所有这些改变都证明.Immt敲除鼠有明显的OXPHOS异常。
总之,Immt敲除鼠的建立,首次为阐明Immt在哺乳动物体内功能提供了研究工具。我们通过对Immt敲除鼠的表型分析,在生物体内证明,IMMT是生命中不可缺少的蛋白分子。它的缺失会导致胚胎死于E10.5天之前,始终未发育出明显的心脏组织结构,神经发育停止。缺失IMMT会引起线粒体嵴空化缺失、紊乱,COX活性下降,OXPHOS功能受损,证明IMMT在线粒体内具有极其重要的功能。
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
生物化学与分子生物学
梁植权;刘德培
2008
中文
R-332
106
2010-12-31(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)