人乳头瘤病毒(HPV)混合型病毒样颗粒疫苗的实验研究
宫颈癌是世界第二大高发妇科肿瘤，慢性持续性高危型人乳头瘤病毒（HumanPapillomavirus，HPV）感染是宫颈癌的主要诱因。目前已发现了包括HPV16，-18，-45等合计15种高危型HPV，其中HPV16，-18是全球范围优势流行的病毒株，因此国外上市的两种预防宫颈癌的病毒样颗粒（VLP）疫苗都只包含HPV16，-18两种型别，可预防HPV16，-18感染相关的约70％的宫颈癌。而其它高危型的流行情况在各个地区的有一定的差异。在我国，除HPV16，-18是诱发宫颈癌的优势流行病毒株之外（检出率分别为58.7％和11％），HPV58的感染率也很高（7.2％），居于第三位，其它如HPV33，-52，-31的检出率也都在2％以上，其中HPV33，-52的检出率比欧美地区相应型别的检出率高。因此，在HPV16，-18的基础上继续增加包括HPV58在内的我国其它主要优势流行病毒型别，研发相应的多价L1 VLP混合型疫苗对于预防我国妇女宫颈癌的发生具有重要意义。
本研究利用杆状病毒-昆虫细胞表达体系，首先通过联合采用偏性密码子、mRNA二级结构调整等多种策略优化改造HPV16，-18，-58病毒主要外壳蛋白L1基因，分别构建高滴度重组杆状病毒，感染昆虫细胞表达L1 VLP，分离纯化HPV16，-18，-58 L1 VLP。然后采用不同的配伍方案，包括剂量配伍及联合佐剂配伍等方案，配制HPV16，-18，-58 L1 VLP多价疫苗，肌肉免疫BALB/c小鼠，通过VLP-ELISA检测免疫血清VLP结合抗体的水平及持续时间，通过假病毒中和实验检测评价血清中和抗体的水平。在分析VLP混合免疫同时诱发针对疫苗组分型别特异性体液免疫反应的基础上，重点分析混合免疫是否存在免疫干扰，并探讨分析诱发免疫干扰的相关因素及克服方法，确立HPV16，-18，-58 L1 VLP混合型多价疫苗的最佳免疫方案。结果如下：
1.HPV16，-18，-58 L1改造基因的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，SDS-PAGE考马斯亮兰染色及Western blot检测发现，L1改造基因可在昆虫细胞中高水平表达，L1重组蛋白纯化后经电镜分析均可自组装成大小及形态与天然病毒类似的病毒样颗粒。
2.按照每种型别VLP5μg的剂量，配制HPV16，-18，-58 L1 VLP三价疫苗，同时设HPV16，-18，-58，-6，-11 L1 VLP五价疫苗及相应单价疫苗为对照组。VLP-ELISA法检测分析结果表明，混合免疫可同时诱发针对疫苗组分型别的高水平VLP-ELISA结合抗体，两次免疫后HPV16，-18，-58 L1 VLP结合抗体的滴度分别高达2×104，2.5×104，2.5×104，三次免疫后针对这三种型别的结合抗体滴度分别高达3.1×104，6.3×104，6.3×104，均可持续至少一年时间，且各型VLP结合性抗体滴度在混合免疫组及单独免疫组之间没有显著差异；假病毒中和实验结果显示，混合免疫血清可同时中和HPV16，-18，-58型假病毒，阻止其报告基因的表达，两次免疫后针对HPV16，-18，-58假病毒中和抗体滴度分别高达4.5×103，104，2.9×103，三次免疫后针对这三种型别的中和抗体滴度分别高达1.5×104，1.5×104，4.5×103，但混合免疫组诱发产生的针对HPV16，-18，-58的中和抗体均较其相应的单独免疫组的低，且五价免疫组诱发的中和抗体水平较三价免疫组进一步降低。表明混合免疫型别之间存在免疫干扰现象。
3.在HPV16，-18 L1 VLP配伍剂量为5μg不变的情况下，将HPV58 L1 VLP的剂量增加至10μg，混合后肌肉免疫。免疫血清中和活性检测发现增加HPV58 VLP的剂量可部分消除对HPV58型的免疫干扰，但对HPV16，-18型的免疫干扰有所增强。
4.在HPV16，-18，-58 L1 VLP每种型别剂量均为5μg的情况下，将其中一种型别的VLP在小鼠一侧后肢肌肉免疫，另外两种混合后在另一侧后肢免疫。免疫血清中和活性检测发现，分为点免疫可以减弱对单独免疫型别的免疫干扰现象，但不能完全消除免疫干扰。
5.将每种型别的VLP剂量降低到0.1μg，配制HPV16，-18，-58 L1 VLP三价疫苗，同时设HPV16，-18 L1 VLP双价疫苗，HPV16，-18，-58，-6，-11 L1 VLP五价疫苗及相应单价疫苗为对照组。假病毒中和实验分析结果显示，低剂量混合免疫可同时诱发针对HPV16，-18，-58的中和抗体，两次免疫后中和抗体滴度分别为4×102，2×102，4×102，对疫苗中所有型别的免疫干扰现象均有所减弱，但免疫干扰程度仍随着疫苗中抗原价次的增加而增强。
6.将氢氧化铝佐剂按比例与低剂量（每型0.1μg）VLP混合，配制复合有佐剂的多价疫苗，包括HPV16，-18双价疫苗，HPV16，-18，-58三价疫苗及HPV16，-18，-58，-6，-11五价疫苗。免疫血清中和活性分析发现，低剂量组复合佐剂免疫后产生的干扰现象较单纯低剂量免疫组的低，并且免疫干扰随疫苗中抗原价次增加而增强的趋势变得不明显。
综上所述，本研究结果发现，联合采用偏性密码子、mRNA二级结构调整的方法自主优化获得的HPV L1基因能在杆状病毒.昆虫细胞表达体系内高水平表达生产L1 VLP，HPV16，-18，-58 L1 VLP混合免疫可同时诱发针对疫苗组分型别的高水平中和抗体，并首次发现HPV VLP混合免疫时会产生免疫干扰，增加某一型别的免疫剂量可部分克服对这种型别免疫干扰，但会增加对其它型别的免疫干扰，降低免疫剂量及联合使用佐剂可普遍地克服疫苗所含型别的免疫干扰，最终确立了HPV16，-18，-58 L1 VLP混合型疫苗的最佳免疫方案。本研究为在复合佐剂的HPV16，-18疫苗的基础上继续增加包括HPV58在内的我国其它主要优势流行病毒型别，研发适合我国国情的宫颈癌预防性疫苗打下基础。
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
病原生物学
王恒;许雪梅
2010
中文
R457.2
93
2010-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）