抗HBV药物的分子药效学评价模型以及减少HBV耐药的策略研究
CccDNA（covalently closed circular DNA）是乙肝病毒（hepatitis B virus）建立以及维持感染的分子基础，并在停药反弹和核苷类药物（nucleotide or nucleosideanologues，NAs）耐药产生方面扮演着关键角色。针对cccDNA增殖机制开发新型抗病毒药物，或者在现有条件下开发新的治疗策略来阻止肝脏细胞内cccDNA分子的形成以及降低cccDNA库是乙肝防治的核心课题之一。
CccDNA增殖过程几乎涉及到整个HBV DNA复制环节，那么临床常用药物在哪个环节抑制cccDNA增殖，有没有主要的作用环节?对于临床耐药率低的NAs有没有特征性的抑制cccDNA增殖的药效规律?深入研究这些问题不仅有助于解释临床耐药现象，更有助于发现强效抑制cccDNA增殖的药物，甚至为联合治疗提供新的研究和评价方法。针对上述问题，本课题采用了临床抗HBV药物作为“小分子药物探针”的研究策略。
氧化苦参碱（OMTR）、膦甲酸钠（PFA）、拉米夫定（3TC）、阿德福韦酯（ADV）和恩替卡韦（ETV）是5种分子结构不同的小分子化合物，在临床上均有明确的抗HBV作用。它们分别属于不同靶点、不同靶位或者同靶位但不同结合方式的药物。OMTR通过降低宿主蛋白HSC70 mRNA的稳定性来抑制HBV复制，PFA作用于HBV复制酶焦磷酸结合的位点；3TC、ADV和ETV三种药物都以病毒复制酶为靶点但结合模式不同。基于这些化合物对HBV复制过程不同机制的干预，有可能通过针对性的研究揭示出它们各自抑制cccDNA增殖的药效规律。
因此本课题主要的研究目的是通过对药物抑制cccDNA增殖机制的研究，寻求增强抗HBV药效以及克服乙肝临床耐药的策略。
本课题建立了一系列qPCR（real-time quantitative PCR，qPCR），用于检测HBV不对称复制过程中主要的复制步骤，即负链、正链复制和cccDNA的合成。在传代HepG2.2.15细胞（整合有HBV全基因组的稳定转染细胞系）内，cccDNA增殖是HBV复制周期中主要的分子事件，HBV包膜蛋白的负反馈调节机制对cccDNA增殖过程影响有限，在此时段内cccDNA自然增殖途径相对“简化”，便于研究药物作用机制。基于上述条件，本课题提出“抗HBV药物的分子药效学评价模型”。该模型基于对HBV主要复制步骤定量地检测，在cccDNA增殖期研究药物作用机制，结合药效动力学和偏相关性分析可以综合地评价药物作用后负链、正链等复制步骤在cccDNA增殖过程中的主次作用，从而判断药物抑制cccDNA增殖的分子药理学机制。因此本模型是一个多层次的研究体系，将特异性HBV不对称复制机制融入到HBV药效学研究中，用于研究药物在HBV整个复制周期中主要的分子药效学机制。
3TC、ADV和ETV三种NAs作用于HepG2.2.15细胞后，可以有效地抑制cccDNA的增殖。因为HBsAg生物学意义和cccDNA相近，本课题对HBsAg胞外分泌水平进行了测量。结果显示HBsAg可以定量、定性地反映NAs作用后cccDNA降低的趋势。
通过对HBV正、负链复制以及cccDNA增殖抑制的剂量-药效曲线整体性地分析，以及结合药效动力学和统计学偏相关分析等方法的数据，结果表明NAs通过不同的分子药效学机制来抑制cccDNA的增殖。3TC、ETV和ADV三种药物可能分别主要在负链复制、正链复制和正链补全阶段发挥抑制cccDNA增殖的药效。其中ETV和ADV的药效学机制进一步得到其它数据的证实。
本室前期工作通过系列实验证实OMTR可降低HSC70 mRNA的稳定性，而HSC70在HBV逆转录过程发挥辅助复制的作用，因此OMTR通过降低HSC70的丰度来抑制HBV复制。本课题进一步发现HSC70蛋白CC区（与底物蛋白结合的功能域）与辅助HBV复制功能密切相关。通过qPCR体系检测OMTR对HBV正、负链以及cccDNA的影响，发现OMTR同等水平地抑制HBV正、负链复制以及cccDNA的增殖，与NAs抑制模式有很大的不同。结合以往研究的结果，OMTR可能主要通过下调负链复制水平来抑制cccDNA的增殖。
PFA抗病毒的药效较弱，在1667μM的剂量时才出现对HBV复制比较明显的抑制作用。PFA抑制HBV正、负链复制以及cccDNA增殖药效大小的顺序为负链<正链<cccDNA。表明PFA在正链补全阶段具有较强的抑制活性，并最终抑制cccDNA增殖。
本课题进一步评价了3TC、ADV和ETV三种NAs联合治疗的药效。数据表明，所有六种NAs联合方案在降低细胞内HBV负链复制上表现为协同或叠加作用。在六种联合方案中，仅3TC和ADV相互联合的两种方案在HBV正、负链复制，以及cccDNA增殖多个层次上表现为协同抑制作用，与临床结果相吻合。以细胞外HBV DNA作为评价指标，结果显示六种NAs联合方案对细胞外HBV DNA水平没有影响。
总之，“抗HBV药物的分子药效学评价模型”具有潜在的理论价值，适用于研究药物抑制HBV cccDNA增殖的分子药效学机制，发现和评价有效的NAs联合治疗方案。
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
微生物与生化药学
蒋建东
2010
中文
R978.7
104
2010-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）