抗HBV药物的分子药效学评价模型以及减少HBV耐药的策略研究
CccDNA(covalently closed circular DNA)是乙肝病毒(hepatitis B virus)建立以及维持感染的分子基础,并在停药反弹和核苷类药物(nucleotide or nucleosideanologues,NAs)耐药产生方面扮演着关键角色。针对cccDNA增殖机制开发新型抗病毒药物,或者在现有条件下开发新的治疗策略来阻止肝脏细胞内cccDNA分子的形成以及降低cccDNA库是乙肝防治的核心课题之一。
CccDNA增殖过程几乎涉及到整个HBV DNA复制环节,那么临床常用药物在哪个环节抑制cccDNA增殖,有没有主要的作用环节?对于临床耐药率低的NAs有没有特征性的抑制cccDNA增殖的药效规律?深入研究这些问题不仅有助于解释临床耐药现象,更有助于发现强效抑制cccDNA增殖的药物,甚至为联合治疗提供新的研究和评价方法。针对上述问题,本课题采用了临床抗HBV药物作为“小分子药物探针”的研究策略。
氧化苦参碱(OMTR)、膦甲酸钠(PFA)、拉米夫定(3TC)、阿德福韦酯(ADV)和恩替卡韦(ETV)是5种分子结构不同的小分子化合物,在临床上均有明确的抗HBV作用。它们分别属于不同靶点、不同靶位或者同靶位但不同结合方式的药物。OMTR通过降低宿主蛋白HSC70 mRNA的稳定性来抑制HBV复制,PFA作用于HBV复制酶焦磷酸结合的位点;3TC、ADV和ETV三种药物都以病毒复制酶为靶点但结合模式不同。基于这些化合物对HBV复制过程不同机制的干预,有可能通过针对性的研究揭示出它们各自抑制cccDNA增殖的药效规律。
因此本课题主要的研究目的是通过对药物抑制cccDNA增殖机制的研究,寻求增强抗HBV药效以及克服乙肝临床耐药的策略。
本课题建立了一系列qPCR(real-time quantitative PCR,qPCR),用于检测HBV不对称复制过程中主要的复制步骤,即负链、正链复制和cccDNA的合成。在传代HepG2.2.15细胞(整合有HBV全基因组的稳定转染细胞系)内,cccDNA增殖是HBV复制周期中主要的分子事件,HBV包膜蛋白的负反馈调节机制对cccDNA增殖过程影响有限,在此时段内cccDNA自然增殖途径相对“简化”,便于研究药物作用机制。基于上述条件,本课题提出“抗HBV药物的分子药效学评价模型”。该模型基于对HBV主要复制步骤定量地检测,在cccDNA增殖期研究药物作用机制,结合药效动力学和偏相关性分析可以综合地评价药物作用后负链、正链等复制步骤在cccDNA增殖过程中的主次作用,从而判断药物抑制cccDNA增殖的分子药理学机制。因此本模型是一个多层次的研究体系,将特异性HBV不对称复制机制融入到HBV药效学研究中,用于研究药物在HBV整个复制周期中主要的分子药效学机制。
3TC、ADV和ETV三种NAs作用于HepG2.2.15细胞后,可以有效地抑制cccDNA的增殖。因为HBsAg生物学意义和cccDNA相近,本课题对HBsAg胞外分泌水平进行了测量。结果显示HBsAg可以定量、定性地反映NAs作用后cccDNA降低的趋势。
通过对HBV正、负链复制以及cccDNA增殖抑制的剂量-药效曲线整体性地分析,以及结合药效动力学和统计学偏相关分析等方法的数据,结果表明NAs通过不同的分子药效学机制来抑制cccDNA的增殖。3TC、ETV和ADV三种药物可能分别主要在负链复制、正链复制和正链补全阶段发挥抑制cccDNA增殖的药效。其中ETV和ADV的药效学机制进一步得到其它数据的证实。
本室前期工作通过系列实验证实OMTR可降低HSC70 mRNA的稳定性,而HSC70在HBV逆转录过程发挥辅助复制的作用,因此OMTR通过降低HSC70的丰度来抑制HBV复制。本课题进一步发现HSC70蛋白CC区(与底物蛋白结合的功能域)与辅助HBV复制功能密切相关。通过qPCR体系检测OMTR对HBV正、负链以及cccDNA的影响,发现OMTR同等水平地抑制HBV正、负链复制以及cccDNA的增殖,与NAs抑制模式有很大的不同。结合以往研究的结果,OMTR可能主要通过下调负链复制水平来抑制cccDNA的增殖。
PFA抗病毒的药效较弱,在1667μM的剂量时才出现对HBV复制比较明显的抑制作用。PFA抑制HBV正、负链复制以及cccDNA增殖药效大小的顺序为负链<正链<cccDNA。表明PFA在正链补全阶段具有较强的抑制活性,并最终抑制cccDNA增殖。
本课题进一步评价了3TC、ADV和ETV三种NAs联合治疗的药效。数据表明,所有六种NAs联合方案在降低细胞内HBV负链复制上表现为协同或叠加作用。在六种联合方案中,仅3TC和ADV相互联合的两种方案在HBV正、负链复制,以及cccDNA增殖多个层次上表现为协同抑制作用,与临床结果相吻合。以细胞外HBV DNA作为评价指标,结果显示六种NAs联合方案对细胞外HBV DNA水平没有影响。
总之,“抗HBV药物的分子药效学评价模型”具有潜在的理论价值,适用于研究药物抑制HBV cccDNA增殖的分子药效学机制,发现和评价有效的NAs联合治疗方案。
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
微生物与生化药学
蒋建东
2010
中文
R978.7
104
2010-12-31(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)