TNF-α诱导肝细胞胰岛素抵抗的机制研究：NADPH氧化酶3源性活性氧的作用
目的：氧化应激在胰岛素抵抗以及糖尿病的发生中起着重要的作用。本研究旨在建立SD大鼠和肝细胞HepG2的胰岛素抵抗模型。观察喂养高脂饲料的SD大鼠肝脏中氧化应激以及胰岛素抵抗的发生。在体外应用TNF-α诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗模型，分析胰岛素抵抗状态下活性氧（ROS）的变化，明确ROS的主要来源，研究TNF-α诱导肝细胞胰岛素抵抗的机制，侧重探讨NADPH氧化酶3（NOX3）在TNF-α诱导的肝细胞胰岛素抵抗中的作用。
方法：以高脂饲料喂养6只4周龄雄性SD大鼠12周，建立大鼠胰岛素抵抗模型。用优越血糖仪以电子感应法测定血糖，放射免疫法检测血清胰岛素水平，ELISA测定血清TNF-α浓度。RT-PCR分析肝脏组织中NOX3、P22PHOX、P47PHOX、P67PHOX和Racl的表达，DHE染色观察肝脏组织中的ROS水平。在体外选用HepG2细胞，用TNF-α（4ng/ml）刺激细胞4d，建立胰岛素抵抗细胞模型。蒽酮法测定培养细胞内糖原水平；用RT-PCR分析TNF-α刺激前后NADPH氧化酶（NOX）家族及其亚组分的表达谱变化；以DCFH-DA探针标记与流式细胞仪检测细胞内ROS水平；应用免疫荧光和Western blot观察P47 PHOX的膜移位；设计合成针对NOX3的小分子RNA（NOX3-siRNA），将其瞬时转染HepG2细胞以干扰NOX3基因的表达；用Western blot检测NOX3及其亚组分如P22PHOX、P47PHOX、P67PHOX和Racl的表达以及胰岛素信号通路中JNK、p-JNK、IRSl、p-IRSl、AKT、p-AKT、GSK和p-GSK水平。
结果：以高脂饲料喂养12周后，大鼠空腹血糖水平略有上升，但与对照组的大鼠相比无显著差异。而胰岛素敏感指数降低，血清TNF-α水平显著升高。蒽酮法的检测结果显示高脂饲料喂养大鼠肝组织糖原含量显著降低，表明肝组织发生了胰岛素抵抗。在胰岛素抵抗状态下，大鼠肝组织中NOX3的表达显著增加，DHE染色显示肝组织ROS水平显著增加，提示ROS在肝胰岛素抵抗发生中起重要作用。在体外实验中，细胞内糖原水平的检测结果显示，TNF-π处理后HepG2细胞内糖原合成量显著降低，表明TNF-α诱导HepG2细胞产生了胰岛素抵抗。TNF-α刺激HepG2细胞导致ROS水平呈浓度和时间依赖性增加。分别用ROS产生途径的抑制剂如NOX抑制剂DPI、线粒体呼吸链酶复合体抑制剂Rotenone、一氧化氮合酶抑制剂L-NAME和黄嘌呤氧化酶抑制剂Oxypurinol预处理HepG2后，再分别用TNF-α（4 ng/ml）刺激，结果显示DPI显著抑制TNF-α诱导的ROS产生，而其它抑制剂处理组的ROS水平无显著性变化。提示NOX是TNF-α诱导HepG2细胞产生ROS的主要来源。RT-PCR结果显示，HepG2细胞中主要表达NOX3及亚组分P22PHOX、P47PHOX、P67PHOX和Racl。进一步应用Western blot分析NOX亚组分的表达变化，结果表明TNF-α处理后亚组分P22PHOX、P47PHOX、P67PHOX和Racl的表达无明显变化，而Real-time PCR和Western blot的结果显示，TNF-α刺激后的NOX3的表达显著升高。观察TNF-α对NOX3活性的调节机理的结果表明，用PKC激动剂PMA预处理可引起TNF-α诱导的ROS水平进一步升高，而PKC抑制剂Hypericin能显著降低TNF-α诱导的氧化应激。培养的HepG2细胞中P47PHOX主要分布在胞浆，而TNF-α处理后P4PHOX发生明显的膜移位。P47 PHOX抑制剂Apocynin能显著抑制TNF-α刺激的P47PHOX膜转位，并且能显著降低TNF-α诱导的ROS水平，表明TNF-α通过PKC途径和P47PHOX的膜移位来调节NOX3活性。为了确定NOX3源性ROS在TNF-α诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗中的作用，我们将NOX3-siRNA转染HepG2细胞，获得低表达NOX3水平的HepG2细胞。分析ROS水平与胰岛素抵抗状态的结果显示，抑制NOX3基因表达后可下调TNF-α引起的氧化应激水平，并促进糖原的合成，改善胰岛素抵抗状态。说明NOX3参与了TNF-α引起的ROS的生成和胰岛素抵抗。在此基础上，我们进一步探讨TNF-α诱导HepG2细胞发生胰岛素抵抗的机制。结果显示，4 ng/ml TNF-α处理HepG2细胞后，伴随NOX3表达与ROS水平的升高，磷酸化的JNK和IRSl的307-Ser磷酸化水平增多，而IRSl的表达显著下调，胰岛素信号通路中AKT和GSK的磷酸化水平也下降。应用JNK抑制剂SP600125处理HepG2能抑制TNF-α的作用，引起JNK和IRS1307-Ser磷酸化水平下调，并提高AKT和GSK的磷酸化水平。干扰NOX3基因的表达也可以逆转TNF-α对胰岛素信号通路的影响，促进肝细胞内糖原的合成。这些结果表明，TNF-α通过NOX3介导的氧化应激诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗，其机理涉及到INK/IRSl/PI-3K/AKT信号通路。
结论：
1.高脂饲料喂养12周的SD大鼠血清TNF-α水平显著升高，胰岛素敏感指数降低，肝组织中NOX3表达和ROS水平显著增加，糖原含量显著降低；
2.TNF-α主要通过上调NOX3的表达和活性显著提高HepG2细胞的ROS水平；
3.NOX3的激活主要通过PKC途径和P47PHOX的膜转位；
4.TNF-α可诱导HepG2细胞发生胰岛素抵抗，其作用机制为：TNF-α可激活JNK信号通路，增加IRSl的307位Scr磷酸化水平，下调IRSI的表达，并显著降低.AKT和GSK磷酸化水平，导致肝细胞糖原合成减少；
5.JNK抑制剂SP600125和干扰NOX3基因的表达可以抑制TNF-α引起的胰岛素抵抗。
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
生物化学与分子生物学
黎健
2010
中文
R587.1
110
2010-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）