豚鼠动脉粥样硬化模型的建立及机理探讨
背景
动脉粥样硬化及其并发症严重危害人类健康。动脉粥样硬化的发病机制复杂，是多种因素长期共同作用的结果。探明动脉粥样硬化发病机理、筛选研究有效治疗药物是国内外研究的重点和难点，而建立一种与人类动脉粥样硬化发病机制、临床表现相一致或接近的整体动物模型则是进行上述研究的关键。近年来，国内外学者使用鸟类、鼠类、兔、猪、非人灵长类动物和转基因动物等用于实验性动脉粥样硬化的研究，在取得诸多进展的同时，也逐步发现模型的缺陷和不足，限制了其应用。研究资料提示，豚鼠是极少数通过LDL携带和转运大部分胆固醇的动物之一，这点与人类极为相似。其次，豚鼠血浆脂质构成、胆固醇和脂蛋白代谢方式上也与人类存在诸多相似之处，对药物治疗的反应性与临床研究结果一致。提示将豚鼠作为由脂代谢紊乱造成的动脉粥样硬化的动物模型，可能具有一定的优势。
目的
探索建立豚鼠动脉粥样硬化模型的方法，使模型具有典型的动脉粥样硬化病变特征。从整体、细胞和分子水平探讨豚鼠动脉粥样硬化的发病机制，并与另一种啮齿类动物大鼠模型进行平行比较，阐明豚鼠作为一种新型动脉粥样硬化动物模型的特点及优势所在。
方法：
将豚鼠和大鼠分别随机分为正常、模型组1组和模型2组。正常对照组饲常规饲料，模型1组饲含0.5％胆固醇、10％猪油的高脂饲料，模型2组饲含1％胆固醇、10％猪油的高脂例料，连续10周的方法建立动脉粥样硬化模型。观测动物体重、摄食量和状态变化。诱导结束后首先检测血清脂质和肝脏脂质的变化；酶联免疫吸附法测定血清CETP、LCAT、hs-CRP和Ox-LDL浓度；取主动脉弓至胸主动脉下端进行苏IV染色，观察主动脉壁内脂质沉积、动脉粥样硬化病灶而积百分比；取主动脉根部至主动脉弓部的动脉进行石蜡切片，Masson染色法观察动脉内膜胶原纤维的变化，HE染色法分析内膜面积/中膜面积、内膜炎性细胞浸涧和内膜表层斑块的形成情况；免疫组化检测皿管内膜ABCA1、CD36、ICAM-1蛋白表达的变化；实时荧光定量法检测肝脏PPARα、LCAT、LDL-R、SR-BI mRNA相对表达的变化，对豚鼠SR-BI基因进行克隆测序。
结果：
1.血脂和肝脂的变化
高脂饲料诱导10周后，与正常组相比，豚鼠两个模型组血浆TC、TG、LDL-C水平均显著升高，形成了典型的高脂血症。而大鼠只有模型1组LDL-C和模型2组TC、LDL-C出现显著升高，且升高幅度明显低于相同条件诱导的豚鼠。豚鼠和大鼠各模型纽肝脏TC和TG均显著性升高，且升高幅度近似。
豚鼠模型1组和模型2组的血清HDL-C水平显著升高了9.9和10.8倍，HDL的两个主要亚型HDL3/HDL2比值也都显著升高，HDL组成和分布发生变化，小颗粒的HDL3堆积。大鼠两个模型组的血清HDL-C水平和HDL3/HDL2比值与正常组相比都末发生变化。
2.动脉粥样硬化病变
正常豚鼠和大鼠主动脉壁光滑、平坦，内皮细胞完整、连接紧密、紧贴于平直的内弹力板上，平滑肌细胞呈长梭形、排列整齐，无炎症细胞聚集，无斑块形成。豚鼠经高脂饲料诱导10周后，主动脉壁大体染色出现斑块（脂质斑块）；高倍镜下观察（×400），内膜明显增厚（表现为大量单核/巨噬细胞来源的泡沫细胞堆积于内膜表层）；内膜单核细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润与聚集增加，大量的泡沫细胞聚集形成斑块；泡沫细胞内富含脂质，细胞外形成脂滴，破坏内膜平滑肌细胞之间的正常连接，使平滑肌细胞被这些脂质包绕分割。少数病变严重的豚鼠主动脉出现细胞外脂质融合和纤维帽，形成纤维斑块。但病灶内未发现明显组织坏死、钙化、斑块破裂出血和血栓形成。按AHA的动脉粥样硬化分期标准，豚鼠模型组形成了Ⅱ-Va型动脉粥样硬化病变，介于动脉粥样硬化的早期和晚期之间。对豚鼠动脉粥样硬化病理变化进行半定量分析，模型1和模型2组斑块的发生率分别为70％（7/10）和75％（6/8），主动脉斑块面积％、纤维面积％、内膜面积％，内膜面积/中膜面积比值较正常对照纽都明显升高。而相同条件诱导下大鼠动脉管壁未形成明显的动脉粥样硬化病变，半定量分析也无显著变化。
3.分子机制研究
与正常组相比，豚鼠模型组肝脏LDL-R mRNA表达下调，血浆Ox-LDL水平显著升高，说明豚鼠正常的LDL-C受体代谢途径受阻，大量LDL被氧化修饰成Ox-LDL。同时豚鼠模型组主动脉CD36蛋白表达上调，说明大量的Ox-LDL经巨噬细胞膜CD36受体摄入细胞内，形成泡沫细胞。豚鼠模型组血浆CETP水平显著升高，一方面促进小而敛密的LDL形成并沉积于动脉，另一方面促进小颗粒HDL3水平相对升高。此外，豚鼠模型组血浆LCAT水平和肝脏LCATmRNA表达都显著下降，表明LCAT催化HDL3向HDL2的酯化转变减少，HDL成熟过程受阻，也是HDL3/HDL2比值升高的原因之一。豚鼠摄入高脂饮食后，主动脉粘附分子ICAM-1蛋白表达增加，促进了炎性细胞的粘附与聚集：血浆hs-CRP1水平升高，提示豚鼠出现血管炎症反应，促进了粥样硬化的发生发展。而相同高脂饮食诱导的大鼠只有模型2组血浆Ox-LDL、hs-CRP水平和主动脉CD36蛋白表达升高，且变化幅度不如豚鼠明显。
此外，高脂饮食的摄入导致豚鼠两个模型组肝脏SR-BI mRNA和主动脉ABCA1蛋白表达代偿性升高，而大鼠未出现此变化。
结论：
1.采用0.5％胆固醇和10％猪油的高脂膳食诱导豚鼠10周可建立典型的动脉粥样硬化模型。
2.与大鼠相比较，豚鼠对饮食性胆固醇更敏感，通过高脂饮食诱导更易于形成动脉粥样硬化病变。
3.豚鼠容易形成动脉粥样硬化病变的原因和机制与血浆脂蛋白的代谢、动脉粥样硬化形成过程中关键酶、蛋白、细胞因子和受体（包括CETP、LCAT、CD36、LDL-R、Ox-LDL、ICAM-1等）的变化有关。
4.此法建立的豚鼠动脉粥样硬化模型具有造模周期较短、指标稳定、操作简便、具有典型动脉粥样硬化病变特征的特点，为脂代谢紊乱及动脉粥样硬化治疗药物筛选和评价提供了一种较为合适的动物模型。
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
硕士
生药学
高南南
2010
中文
R541.4
96
2010-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）