大白菜霜霉菌诱导抑制性消减cDNA文库的构建及防御相关基因的表达分析
大白菜[Brassica campestris L.ssp.Pekinensi（Lour.）Olsson]是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一，并逐渐成为世界性蔬菜作物。大白菜霜霉病是由霜霉菌（Peronospora parasitica）引起的，从苗期到包心期或种株开花到结荚期均易发病，该病的发生会严重影响大白菜的产量及品质，因此研究大白菜抗霜霉病机理对大白菜的育种工作具有重要意义。
本研究以抗霜霉病大白菜为材料，构建了霜霉病诱导表达的正向抑制性消减文库，研究了大白菜在霜霉病诱导下的差异表达基因；同时采用PCR技术克隆了5个防御基因的片段，通过应用荧光定量的方法研究了它们在侵染霜霉菌后的表达情况，为进一步揭示大白菜霜霉病抗性的分子机制及分子标记辅助育种打下良好基础。主要研究结果如下：
1.以抗霜霉病DH系T12-19为材料，分别用接种大白菜霜霉病菌和喷蒸馏水0、6、12、24、48和72 h的双链cDNA混合池作为Tester和Driver，构建正向消减cDNA文库。经蓝白斑筛选，文库的重组率为87.3％，获得阳性克隆768个。文库的插入片段分布在200-1000 bp，主要集中在200-500 bp。
2.利用反向Northern斑点杂交技术对正向文库的768个阳性克隆进行了筛选，共荻得57个病原菌诱导上调表达的克隆；测序后得到55条通读EST；对这些EST序列进行聚类和拼接分析，共获得50个unigenes；经BLAST比对结果表明，37个unigenes与已知基因高度同源，占全部非重复序列的67.3％；对已知功能基因进行功能分类，发现这些基因的功能主要涉及物质与能量代谢、转录调控、蛋白质合成与代谢、膜及转运、信号转导、抗病防御等。此外，采用实时荧光定量PCR技术分析了文库中3个克隆在霜霉菌诱导下的表达谱，结果表明，这3个克隆在接种病菌6 h后明显上调表达，与反向Northern斑点杂交结果基本一致。
3.采用PCR同源扩增技术克隆了5个候选防御基因PR-1、PR-2（β-1，3-glucanase）、PR-5（thaumatin like）、PAL和F日的cDNA片段。利用荧光定量PCR技术分析了这些防御基因在接种霜霉菌后的表达情况。结果表明，霜霉菌诱导后，2个编码病程相关蛋白的基因BRPR1和BRPR5在接种霜霉菌12 h后明显上调，而BRPR2在接种霜霉菌6 h后明显上调，之后逐渐恢复到正常水平；编码苯丙氨酸解氨酶的基因BRPAL在接种病菌6 h后明显上调，12 h后下调表达；花青素早期合成相关基因BRF3H在接种霜霉菌后的表达水平相比0 h下调表达，但是与6 h、12 h、24h喷水对照相比没有明显的变化，48 h后又恢复到正常水平。
大白菜;霜霉病菌;抑制性消减文库;基因表达
南京农业大学
硕士
蔬菜学
朱月林;张凤兰
2010
中文
S634.1
61
2010-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）