Nampt抑制剂FK866抗星形细胞胶质瘤作用及机制研究
尼克酰胺磷酸核糖转移酶（Nicotinamide Phosphoribosyltransferase，Nampt），是哺乳动物体内尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）生物合成的限速酶，通过合成NAD广泛参与调节细胞内重要生理病理过程。近年来研究发现，Nampt与肿瘤的关系密切，Nampt已经成为一些肿瘤药物治疗的新靶点，体内外研究表明其特异性抑制剂FK866（APO866）具有明显抗肿瘤活性，可诱导肿瘤细胞凋亡及自吞噬，并已作为抗部分实体瘤的新药进入临床Ⅱ期试验。星形细胞胶质瘤是最常见的脑肿瘤，恶性度高，对传统抗肿瘤药物均不敏感。研究发现正常星形胶质细胞不表达Nampt，但在星形细胞胶质瘤细胞出现大量诱导表达，且其表达与肿瘤的恶性程度正相关。为研究Nampt是否可以作为抗星形细胞胶质瘤的新靶点，FK866是否有抗星形细胞胶质瘤的作用，我们采用大鼠星形细胞胶质瘤C6细胞株，观察FK866对细胞活性、细胞凋亡及自吞噬、细胞周期和细胞增殖的影响；并初步研究FK866抗肿瘤活性与MARK通路和p53之间的关系。结果发现：
（1）MTT试验发现FK866时间和浓度依赖性地抑制C6细胞活性，其抑制作用能够被Nampt的直接代谢产物NMN（0.01-1 mM）逆转。FK866对C6细胞活性的抑制作用需48-72 h，作用72 h后的最大抑制率达86.3％，IC50约为10 nM（-8.07logM），远远低于临床胶质瘤治疗药物顺铂（-5.83 logM）和替莫唑胺（-2.82 logM）；FK866还能够浓度依赖性的抑制三种人星形细胞胶质瘤细胞株SHG44、U251和BT325的活性，IC50与C6细胞的IC50接近，Western blot发现这些细胞均有Nampt的表达；而原代培养大鼠星形胶质细胞也有Nampt的表达，其细胞活性同样能够被FK866抑制，但免疫荧光染色发现在小鼠脑内正常星形胶质细胞并无Nampt表达。
（2）流式细胞检测发现FK866100 nM可引起部分细胞凋亡，而10和100 nM均可引起细胞内出现LC3阳性颗粒，显示细胞发生自吞噬，但自吞噬抑制剂3MA和LY294002对FK866引起的细胞活性下降无明显抑制作用，说明细胞活性的显著下降与自吞噬无明显关系。
（3）MTT试验和细胞计数均发现FK866作用48 h后能够浓度依赖性的抑制C6细胞增殖，其IC50约为40nM，1 mMNMN可抑制FK866的作用；流式细胞检测细胞周期发现，40 nM FK866作用48 h可使G2期细胞百分率由8.78％上升到21.25％（P<0.001），G1期细胞的百分率由61.93％下降到48.78％（P<0.001），S期的百分率无明显变化，显示FK866诱导C6细胞发生G2/M阻滞，该作用同样能够被1 mM NMN逆转。
（4）Western blot发现C6细胞在生长过程中，有明显ERK1/2激活，而：FK86640 nM作用48 h能够显著抑制ERK1/2磷酸化，但对JNK和p38无明显影响；ERK1/2抑制剂U0126可浓度依赖性抑制C6细胞的活性，与FK866合用时的抑制效应与单独应用时的作用相近，提示两者对细胞活性的抑制作用是通过共同的通路。U012620μM对C6细胞的细胞周期无影响，而U012640μM可使G1期细胞增加，S期细胞减少，产生G1/S阻滞，提示FK866诱导的G2/M阻滞与ERK抑制无关。p53抑制剂PFT对FK866诱导的G2/M阻滞无影响。
我们的研究显示，FK866通过抑制Nampt酶活性→减少NAD的合成→抑制ERK激活→抑制细胞增殖→抑制细胞活性；另外，可诱导部分细胞发生自吞噬，高浓度时可诱导细胞凋亡，同时可引起p53和ERK非依赖的细胞周期G2/M阻滞，其中FK866对肿瘤细胞细胞周期和细胞增殖的调控是我们首次发现。结果表明Nampt是星形细胞胶质瘤的一个药物治疗新靶点，其抑制剂FK866可能是一个高效的抗胶质瘤新型药物，然而FK866在星形细胞胶质瘤中的作用方式和机制可能有一定的特异性，需要进一步研究。
尼克酰胺磷酸核糖转移酶;星形细胞胶质瘤;G2/M阻滞;生理病理;抗肿瘤活性
浙江大学医学部;浙江大学;浙江大学医学院
硕士
药理学
张纬萍
2010
中文
R979.1
50
2010-12-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）