α-硫辛酸对氧化损伤大鼠肝细胞糖代谢关键酶的影响及其机制的研究
目的：
研究α硫辛酸对氧化损伤大鼠肝细胞的保护作用及糖代谢关键酶表达的影响,为进一步研究α-硫辛酸改善糖尿病代谢紊乱的分子机制提供实验依据。
方法：
采用不同浓度的H2O2(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L)诱导正常大鼠肝细胞(BRL)建立氧化损伤的细胞模型,并通过细胞形态学观察、MTT实验和抗氧化指标的检测进行模型鉴定。
将细胞分为5组,正常对照组、损伤模型组(H2O2浓度为0.2 mmol/L)损伤+低剂量α-硫辛酸组(α-LA-L组)、损伤+中剂量α-硫辛酸组(α-LA-M组)、损伤+高剂量α-硫辛酸组(α-LA-H组),其中α-硫辛酸的浓度分别为50、100、200μmol/L。通过测定细胞活力、抗氧化指标、细胞凋亡率,Western blot技术检测B细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、凋亡活化基因Bax蛋白表达的情况,研究α-硫辛酸对氧化损伤细胞的保护作用。
采用葡萄糖氧化法检测正常培养液及各组细胞内葡萄糖的含量,计算葡萄糖消耗量。采用酶联免疫免疫法(ELISA)检测细胞葡萄糖激酶(glucokinase,GK)、糖原合成酶(glycogen synthase,GS)、丙酮酸脱氢酶-E2(pyruvatedehydrogenase-E2,PDH-E2)蛋白表达水平；采用实时定量PCR技术检测细胞糖代谢中关键酶GS、GK、PDH-E2基因的mRNA表达情况；并通过Western blot技术检测胰岛素和细胞凋亡信号通路中蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)蛋白表达的情况。
结果：
与正下常对照组相比,0.05～0.2 mmol/L H2O2损伤组细胞变形,但细胞边界尚清楚,0.4和0.8mmol/L H2O2损伤组细胞明显变形,胞膜边缘不清晰,有较多细胞脱落。H2O2损伤组细胞活力降低(P<0.05),并且随着H2O2浓度升高,细胞活力降低(P<0.05)。H2O2损伤组细胞谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性降低,丙二醛(maleic dialdehyde,MDA)含量升高(P<0.05)。
形态学观察,H2O2损伤组细胞变形,细胞间隙增大,α-LA-L组与H2O2损伤组相比,细胞形态稍有改善,细胞间隙缩小,细胞间连接增加；α-LA-M和α-LA-H组与损伤组比较,细胞间隙明显缩小,形态基本恢复正常。α-硫辛酸组细胞细胞活力、GSH-Px和SOD活性高于H2O2损伤组,MDA含量和细胞凋亡率低于损伤模型组(P<0.05)。H2O2损伤组细胞Bcl-2的蛋白表达水平低于正常对照组(P<0.05),α-硫辛酸各组细胞Bcl-2蛋白表达量高于H2O2损伤组。H2O2损伤组细胞Bax蛋白表达高于正常对照组,α-硫辛酸组细胞Bax蛋白表达量低于H2O2损伤组(P<0.05)。
H2O2损伤组细胞的葡萄糖消耗量低于正常对照组(P<0.05),与H2O2损伤组比较,α-硫辛酸各组细胞的葡萄糖消耗量升高(P<0.05)。损伤模型组细胞GK、GS和PDH-E2的蛋白表达量均低于正常对照组(P<0.05),α-硫辛酸GK、GS、PDH的蛋白表达量高于损伤模型组,(P<0.05)。损伤模型组细胞GK、GS、PDH-E2的mRNA表达低于正常对照组,α-硫辛酸GK、GS、PDH-E2的mRNA表达量高于损伤模型组(P<0.05),随着α-硫辛酸剂量的增高,各指标均有升高趋势(P<0.05)。损伤模型组细胞Akt蛋白表达量低于正常对照组,α-硫辛酸后表达量升高(P<0.05)。
结论：
α-硫辛酸可以通过提高氧化损伤肝细胞SOD活力、增加细胞GSH-Px活性、降低细胞中MDA含量,上调Bcl-2的蛋白表达水平,下调Bax的蛋白表达水平,降低细胞凋亡率,对氧化损伤肝细胞起到一定的保护作用。
α-硫辛酸可以促进葡萄糖分解,增加细胞对葡萄糖的消耗,降低细胞培养液中葡萄糖的含量。α-硫辛酸可以通过上调氧化损伤肝细胞GK、GS和PDH-E2的mRNA和蛋白表达水平,上调胰岛素信号传导通路(PI3K-Akt)中关键信号分子Akt的蛋白表达水平,在一定程度上改善氧化损伤对肝细胞糖代谢的影响。
α-硫辛酸;氧化应激;胰岛素抵抗;糖代谢关键酶;糖尿病;代谢紊乱;葡萄糖氧化法;动物模型
天津医科大学
硕士
营养与食品卫生学
吴蕴棠
2010
中文
R587.1
85
2010-12-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）