叶酸通过MAPK通路对体外缺氧神经干细胞增殖作用的研究
目的:通过培养体外缺氧神经干细胞,观察叶酸对缺氧神经干细胞(NSCs)增殖的影响,并探讨其作用机制。
方法:采用无血清体外细胞培养方法,培养新生大鼠NSCs,将NSCs分为5组:①对照组(control)；②缺氧模型组(Hypoxia)；③缺氧叶酸缺乏组(Hypoxia+Folate-D)；④缺氧叶酸低剂量组(Hypoxia+Folate-L)；⑤缺氧叶酸高剂量组(Hypoxia+Folate-H),除对照组外其他四组建立缺氧模型。按照复氧3h,6h,12h,24h收集增殖细胞,倒置显微镜下初步观察叶酸对NSCs增殖的影响,免疫荧光染色法对分离培养的NSCs进行鉴定；采用MTT法检测叶酸对NSCs增殖的影响；荧光定量PCR方法检测3h、6h、12h、24h ERK1/2的mRNA表达；并用Western blot方法检测每个时间点pERK1/2蛋白表达水平。
在加入MAPK通路抑制剂U0126的条件下,将NSCs分为6组:①对照(Control)组；②溶剂对照(DMSO)组；③U0126(U0126)组:④U0126+叶酸缺乏(U0126+Folate-D)组；④U0126+低剂量叶酸(U0126+Folate-L)组；⑤U0126+高剂量叶酸(U0126+Folate-H)组,除对照组外其他五组建立缺氧模型。收集复氧后3h,6h,12h,24h细胞,采用MTT法检测叶酸对NSCs增殖的影响；收集复氧后6h细胞,荧光定量PCR方法检测ERK1/2 mRNA表达水平；用Western blot方法检测pERK1/2表达水平。
结果:镜下观察发现正常培养状态下NSCs成团生长,游离、松散细胞较少,球体较大,数量较多,而缺氧状态下的NSCs,数量较少,细胞松散,球体较小。接种后立即在相差显微镜下观察,细胞呈大量圆形亮点,边界清楚,折光性强。24h后细胞形成大量悬浮的、不规则细胞团块,部分细胞贴壁,出现较多细胞碎片,随着时间的推移,大部分悬浮细胞不断分裂生长,由含数个细胞的小细胞团,逐渐长成由几十个到近百个细胞组成大小不一的悬浮细胞球,BrdU标记免疫荧光显示NSCs成绿色荧光。MTT法检测确定缺氧时间为8h,并检测加入U0126条件下NSCs的细胞活性,6h增殖达到高峰,之后维持在这个水平,且叶酸的加入能促进增殖,叶酸缺乏抑制增殖。荧光定量PCR检测ERK1/2表达水平,复氧6h表达到达高峰,之后维持在这个水平,叶酸缺乏组低于对照组；加入U0126条件下,6h表达到达高峰,之后也维持在这个水平,U0126+叶酸缺乏组低于U0126组。Western blot法检测磷酸化ERK1/2蛋白表达水平,复氧6h表达到达高峰,之后维持在这个水平,叶酸缺乏组低于对照组；加入U0126条件下,6h表达到达高峰,之后也维持在这个水平,U0126+叶酸缺乏组低于U0126组。
结论:叶酸能促进缺氧后复氧的NSCs增殖,且复氧6h是增殖高峰,缺氧后复氧能激活ERK通路,使ERK1/2磷酸化。补充叶酸可促使ERK1/2活化,提高ERK1/2mRNA和pERK1/2表达水平,且叶酸可能是通过ERK信号通路使ERK1/2磷酸化,促进复氧后神经细胞的存活。
叶酸;神经干细胞;信号通路;蛋白表达
天津医科大学
硕士
营养与食品卫生学
黄国伟
2010
中文
R741.05
53
2010-12-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）