产γ-谷氨基甲酰胺合成酶的菌株的选育
γ-谷氨基甲酰胺合成酶(γ-glutamylmethylamide synthetase，γ-GMAS)(EC6.3.4.12)是一种连接酶，可在ATP和Mn2+存在的条件下催化谷氨酸和甲胺合成γ-谷氨基甲酰胺。γ-谷氨基甲酰胺与茶氨酸（γ-谷酰基乙酰胺）的结构很相似，因此在一定条件下γ-谷氨基甲酰胺合成酶可同样催化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸，这为茶氨酸的合成提供了又一思路。
目前国外报道该酶主要存在于细菌体内，包括普通生丝微菌，假单胞菌以及一些以甲胺为唯一碳氮源的海生甲基营养生物。近年来国外关于γ-谷氨基甲酰胺合成酶合成茶氨酸的研究报道较多，但是尚未见到关于假单胞菌液态发酵生产γ-谷氨基甲酰胺合成酶的相关报道，鉴于此，本论文对假单胞菌液态发酵生产γ-谷氨基甲酰胺合成酶进行了研究。首先利用紫外线诱变假单胞菌，从中筛选出产γ-谷氨基甲酰胺合成酶酶活较高的优势突变菌株；然后通过PlackettBurman和RSM响应面设计优化发酵条件，提高酶产量；最后对γ-谷氨基甲酰胺合成酶进行粗提并研究了其部分酶学性质，以期为γ-谷氨基甲酰胺合成酶的进一步研究提供理论基础和科学依据。
主要研究结果有：
首先，以假单胞菌为出发菌株，对其进行紫外诱变处理，经过初筛复筛获得了一株产γ-谷氨基甲酰胺合成酶酶活较高并且遗传稳定性较好的优势突变菌株UV-19。
其次，以紫外诱变获取的优势突变菌株为实验菌株，发酵所产γ-谷氨基甲酰胺合成酶酶活为指标，筛选出了发酵产酶的最适碳源、氮源、溶氧转速、培养温度、培养时间、诱导底物，并通过Plackett-Burman(PB)设计筛选发酵培养的主要影响因素，确定了突变菌株液态发酵产酶培养基主要影响因素为葡萄糖(p=0.0003)、蛋白胨(p=0.0244)、起始pH值(p=0.0033)和装液量(p=0.0122)。
再次，在PB设计实验的基础上，以γ-谷氨基甲酰胺合成酶酶活为指标，运用响应面法(Response Surface Methodology,RSM)的旋转中心组合试验设计对筛选出的主要影响因素进一步优化，确定了优势突变菌株发酵产γ-谷氨基甲酰胺合成酶最适宜的发酵产酶条件：葡萄糖15.0g/L、蛋白胨12.0g/L、氯化钠5.0g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、甲胺盐酸盐1.0g/L、起始pH值6.5、装液量72mL/250mL、发酵时间42h、温度30℃、转速160r/min。
最后，对优势突变菌株所产γ-谷氨基甲酰胺合成酶进行粗提，对粗酶的部分特性（最适温度及温度稳定性，最适pH及pH稳定性，金属离子等的影响）进行研究，确定该酶与底物的最佳作用时间为40min，最适反应温度为40℃，10-30℃间稳定性较好，最适反应pH为7.5，pH5.5-6.5范围内稳定性较好，金属离子Mn2+、Mg2+对γ-谷氨基甲酰胺合成酶有一定的激活作用。
假单胞菌;γ-谷氨基甲酰胺合成酶;紫外诱变;Plackett-Burman设计;响应面分析;酶学性质;菌株选育
安徽农业大学
硕士
营养与食品卫生学
李平
2010
中文
TQ925
46
2011-05-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）