Livin反义寡核苷酸对膀胱癌细胞抑制作用的实验研究
近年来,人们发现凋亡过程受到抑制在肿瘤的发生、发展中起到非常关键的作用。其中IAPs在细胞的凋亡中扮演非常重要的角色,某些IAPs成员异常高表达常引起组织细胞凋亡受阻,与肿瘤的发生密切相关。目前已发现的人类IAP家族有8个,包括NAIP、ILP-2、c-IAP1、c-IAP2、XIAP、Bruce、survivin及Livin。其中Livin是最近发现的IAPs家族新成员,主要在一些肿瘤组织细胞中高表达,在正常组织不表达或极少表达,可能成为肿瘤治疗的靶点。我们的前期研究在膀胱癌患者尿液中也发现有Livin mRNA的表达,而健康志愿者无表达。
目的:
在我们的前期工作基础上,我们拟利用反义核酸技术,在体、内外阻断膀胱癌细胞Livin mRNA及蛋白质的表达,观察癌细胞的生长以及凋亡是否受到影响,以明确Livin在膀胱癌细胞中的作用,并初步探讨其机制。为以Livin为靶基因的膀胱癌的治疗提供理论依据。
方法:
一.设计、合成全硫代修饰Livin反义寡核苷酸序列及其功能鉴定。
1.参考文献设计、筛选、合成全硫代修饰Livin反义寡核苷酸。同时设计一条错义序列寡核苷酸作为对照。
2.制作Livin反义寡核苷酸-LipofectamineTM2000复合物,将其转染入5637膀胱癌细胞中。
3.荧光显微镜观察转染效率。
4.用RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光检测转染后膀胱癌细胞Livin mRNA及蛋白表达的变化。
二.细胞分组
根据向培养细胞中加入的成分不同,分为:
(1)反义组:加入反义寡核苷酸;
(2)错义组:加入错义的寡核苷酸;
(3)脂质体组:只加入等量稀释的脂质体;
(4)PBS(磷酸缓冲液)组:只加入等量的PBS。
三.Livin反义寡核苷酸对人膀胱癌细胞株5637生物学活性的影响
1.以不同浓度的Livin反义寡核苷酸转染培养的膀胱癌细胞,用MTT法测定细胞增殖活性。从中筛选出适当的Livin反义寡核苷酸浓度,进行下一步实验。
2.Livin反义寡核苷酸对膀胱癌细胞的生物学效应
①激光共聚焦显微镜、透射电子显微镜观察膀胱癌细胞转染Livin反义寡核苷酸后的形态学变化。
②AO/EB双染色、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
四.Livin反义寡核苷酸诱导荷瘤鼠膀胱癌组织凋亡的研究
1.裸鼠膀胱癌移植瘤模型的建立
采用皮下注射法建立裸鼠膀胱癌移植瘤模型。
2.给药方法及分组
采用瘤体内5点注射法,根据注射核酸的不同,将裸鼠随机分为对照组(瘤体内注射错义寡核苷酸)和反义组(瘤体内注射反义寡核苷酸)。
3.Livin反义寡核苷酸对荷瘤鼠肿瘤组织Livin表达的影响
用RT-PCR、Western blot检测检测转染后膀胱癌细胞Livin mRNA及蛋白表达的变化。
4.Livin反义寡核苷酸对荷瘤鼠肿瘤组织的生物学效应
①用游标卡尺测量、计算肿瘤体积,绘制癌细胞体内生长曲线。接种后第30天剥瘤称重。
②H.E染色光镜观察肿瘤组织转染Livin反义寡核苷酸后的形态学变化。
③TUNEL法检测荷瘤鼠肿瘤细胞凋亡情况。
④免疫组化检测荷瘤鼠肿瘤caspas-3的表达情况。
结果:
一.Livin反义寡核苷酸能有效转染入膀胱癌细胞内并抑制LivinmRNA及蛋白的表达。
将FITC标记的Livin ASODN转染膀胱癌细胞后,在荧光显微镜下观察,见约55%的细胞染上绿色荧光,说明Livin ASODN能有效地转染入5637细胞中。
RT-PCR扩增后显示5637细胞表达livinα和livinβ,但反义组的电泳带亮度明显低于错义组、脂质体组及PBS组,而后三组间亮度相似。反义组livin两个片段的mRNA相对表达量(0.46±0.05)较错义组(0.88±0.05)、脂质体组(0.92±0.04)、PBS组(0.91±0.06)明显减弱,P<0.01,而各对照组间比较无显著性差异,P>0.05。
采用Western blot检测各组细胞中livin蛋白的表达,结果反义组livinα和livinβ杂交带亮度明显低于错义组、脂质体组和PBS组。
细胞免疫荧光染色后用激光共聚焦显微镜观察,发现反义组癌细胞标记livin的绿色荧光明显减弱,且见有的细胞体积明显缩小,完全无绿色荧光。其余各对照组无明显变化。
说明Livin反义寡核苷酸能有效抑制膀胱癌细胞Livin mRNA及蛋白的表达。
二.Livin反义寡核苷酸对人膀胱癌细胞增殖活性的影响
MTT法发现Livin反义寡核苷酸能抑制人膀胱癌细胞的增殖活性,且其抑制作用呈明显的浓度依赖性。我们据此选择160nmol/L的寡核苷酸浓度进行下一步实验。
三.Livin反义寡核苷酸对膀胱癌细胞的生物学效应
①细胞形态的变化:激光共聚焦显微镜、透射电子显微镜下见反义组可见较多细胞体积肿大、细胞器肿胀、变性坏死。有的细胞体积缩小,发生凋亡,甚至形成凋亡小体。
②细胞凋亡率的变化:AO/EB双染色、Annexin V-FITC标记凋亡细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果发现反义组的细胞凋亡率(46.39±9.23)%显著高于PBS组(4.54±1.84)%、脂质体组(5.70±1.61)%及错义组(5.10±1.56)%,P<0.01。而后三组间凋亡率差异无显著意义,P>0.05。
三.Livin反义寡核苷酸对荷瘤鼠肿瘤组织的抑制作用
1.Livin反义寡核苷酸对荷瘤鼠肿瘤组织Livin表达的影响
RT-PCR扩增后显示,反义组荷瘤鼠肿瘤组织表达livinα和livinβ的电泳带亮度明显低于对照组。
Western blot检测荷瘤鼠肿瘤组织livin蛋白的表达,结果反义组livinα和livinβ杂交带亮度明显低于对照组。
免疫组化也显示反义组livin表达减弱(其面积积分光密度为:0.1661±0.1028,对照组为0.2490±0.1483,P<0.05)
说明 Livin反义寡核苷酸在体内也能有效抑制膀胱癌细胞LivinmRNA及蛋白的表达。
2.Livin反义寡核苷酸对对荷瘤鼠肿瘤组织的生物学效应
①肿瘤生长的变化:通过测量、计算肿瘤体积,绘制癌细胞体内生长曲线。发现从肿瘤接种后的第18天开始至接种后第30天,反义组肿瘤体积显著小于对照组,P<0.05。接种后第30天剥瘤称重,反义组瘤块重量为1.31±0.88g,明显轻于对照组(2.41±0.41g),P<0.05。说明Livin反义寡核苷酸能在体内抑制了肿瘤的生长。
②H.E染色光镜观察肿瘤组织转染Livin反义寡核苷酸后的形态学变化:可见反义组肿瘤组织有局灶变性、坏死现象及炎症细胞浸润。
③肿瘤细胞凋亡情况:TUNEL法检测荷瘤鼠肿瘤组织凋亡指数,结果发现反义组为19.60±5.91,明显高于对照组(3.48±2.35),P<0.05。
④免疫组化检测荷瘤鼠肿瘤caspas-3的表达情况:反义组肿瘤组织caspas-3表达显著强于对照组(面积积分光密度分别为:反义组0.4501±0.1618,对照组0.3601±0.1065,P<0.05)。说明Livin反义寡核苷酸抑制了Livin的表达后,解除了Livin对caspas-3的抑制作用,从而使caspas-3的表达增强。
结论:
一.人膀胱癌细胞株5637表达Livin两个异构体。
二.Livin在人膀胱癌细胞的增殖及凋亡过程中扮演重要角色。
三.Livin抑制膀胱癌细胞凋亡的可能机制之一是其抑制了Caspase-3的活性。
四.我们合成的Livin反义寡核苷酸在体内、外均能有效抑制膀胱癌细胞Livin mRNA及蛋白的表达、抑制癌细胞的生长、诱导癌细胞凋亡。
五.Livin反义寡核苷酸可能成为膀胱癌基因治疗的潜在方法之一。
Livin;反义核酸;寡核苷酸类;膀胱肿瘤;细胞凋亡;蛋白表达
重庆医科大学
博士
外科学(泌尿外科学)
吴小候
2008
中文
R737.14;R730.2
95
2011-05-31(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)