乙酰胆碱酯酶及发光菌检测有机磷农药毒性的研究
目的：有机磷农药(organophosphates pesticide,OPs)污染问题日益严峻,迫切需要能连续、及时、准确反映其污染状况即毒性的方法,实现在线监测。乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE,EC3.1.1.7)检测法相较于传统仪器检测法,具有反应灵敏、操作简便、成本低、易携带等优点,更适合在线监测。但由于市售AChE价格昂贵,且不同来源AChE对OPs的敏感性不同,一定程度上抑制了AChE分析法的优势；另外,目前AChE检测法主要检测OPs的单一毒性,缺少对联合毒性的研究,分析结果不够全面客观。本研究的目的就是制备活性高的对OPs敏感的AChE,利用该酶分析几种有机磷农药的单一毒性和联合毒性,并与发光菌毒性测试结果作比较,提高AChE检测法在毒性在线监测方面的优势,为今后有机磷农药毒性评价标准的制定提供基础数据和技术支持,也为后续毒性在线监测仪器开发提供基础。
方法：实验选择对水环境较敏感、容易获得的鲫鱼为酶源,由鱼脑中提取AChE,通过对提取方法的优化,单因素实验和正交实验,盐析、透析、凝胶层析等纯化步骤,获得活性较高的对OPs敏感的靶酶。然后,利用OPs对AChE活性的抑制,检测鲫鱼脑AChE对几种有机磷农药的敏感性,在此基础上检测有机磷农药二元混合物对AChE的联合作用,通过共毒法评价混合物的联合作用方式。接着,利用发光菌检测同样几种OPs的单一毒性和联合毒性,通过计算半数抑制浓度EC50值,采用毒性单位法、相加指数法、混合霉性指数法评价有机磷农药的联合作用方式。
结果：实验确定了鲫鱼脑.AChE与底物反应的最佳条件为:200mmol/L底物、20μl酶液、pH8.0的PBS、30℃水浴30min；纯化后的AChE的活性为5171.76μmol/min/mg,AChE对OPs的敏感性因农药的不同而不同:敌敌畏>敌百虫>乙酰甲胺磷>氧乐果>三唑磷,AChE对五种OPs的检出浓度分别为1.69μg/ml、3.78μg/ml、4.03μg/ml、7.32μg/ml和8.03μg/ml。利用T3发光菌检测有机磷农药的单一毒性,表明发光菌相对发光率与有机磷农药浓度呈负相关,相关系数在0.93～0.98间。利用鲫鱼脑AChE和发光菌检测评价五种有机磷农药的联合作用,结果表明有机磷农药二元混合物联合作用方式基本一致:协同作用和部分相加作用。
结论：鲫鱼脑AChE活性较高,对OPs更敏感,可以提高AChE分析法在毒性在线监测应用方面的优势；利用鲫鱼脑AChE分析法和发光菌毒性测试法对OPs联合毒性进行评价,两种方法结果基本一致,证明AChE分析法的评价结果可信,也说明混合物的联合毒性不等于单一毒性之和,毒性评价标准的制定应该考虑联合毒性的作用。
有机磷农药;乙酰胆碱酯酶;联合毒性;发光菌;在线监测
重庆医科大学
硕士
遗传学
彭惠民
2010
中文
X839.2
54
2011-05-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）