生物催化法制备苯乙酮酸的研究
苯乙酮酸(PGA)，又称苯甲酰甲酸，是应用广泛的有机合成中间体。本实验室从铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中克隆得到扁桃酸消旋酶的编码基因(mdlA)和扁桃酸脱氢酶基因(mdlB)，已成功构建了可将扁桃酸转化为苯乙酮酸的重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pEt30a(mdlA+mdlB)，并且在IPTG诱导下有较高的表达量。本文在以上工作的基础上，从该工程菌株的性质出发，对菌体培养条件进行系统优化，旨在获得高菌体密度的同时保证有较高的蛋白表达量；除获得高密度、高活力菌体外，提高苯乙酮酸产率的另一个重要方面就是转化工艺条件的优化。菌体只有在最适宜的转化条件下，才能表现最佳的转化活力，保证苯乙酮酸的产率实现最大化。具体实验设计及结果如下：
对重组菌的基本性质和诱导培养条件进行了研究。选用乳糖代替IPTG作为诱导剂，采用摇瓶培养，相继确定了乳糖最适添加浓度为5g/L、添加时间4h、诱导培养时间8h、诱导前培养温度37℃，诱导培养温度30℃等一系列适合该工程菌高效表达重组蛋白的诱导条件。
为获得高密度、高活力菌体，采用统计学优化方法对该重组菌的培养基组成及培养条件进行优化研究。首先，利用Plackett-Burman试验设计筛确定三个主要影响因素，即碳、氮源浓度和pH值；在此基础上用最陡爬坡路径逼近最大响应区域；再以菌体转化比活力(即蛋白表达量)为考察指标进行CCD试验设计，并对实验数据进行回归分析，通过求解回归方程得到三个显著因素的最优取值，即碳源浓度6.34g/L，复合氮源浓度为13.56g/L，pH值为7.7。在此条件下，模型预测最高响应值为18.5276 U/g。经五批次培养验证实验，预测值与验证试验平均值非常接近，表明该模型能很好地预测实际的培养条件。
在对菌体培养条件进行优化，成功获得高密度、高活力菌体后，为进一步提高重组菌转化苯乙酮酸的能力，对重组菌转化条件进行了详细的研究。最终确定转化反应最适条件为：底物浓度为20g/L，细胞浓度为10g/L，磷酸体系浓度67mM，pH6.0，37℃，200rpm。在此条件下，转化比活力又有所提高，可达到20.5273U/g，转化反应进行8h即完成转化。
通过上述对培养条件和转化条件的优化实验，当底物扁桃酸浓度为2％时，重组菌在8h可完全转化，与未经优化的原始条件相比，在底物浓度提高了1倍的同时转化反应时间缩短了40h。
苯乙酮酸;生物催化;基因工程菌;表面响应法;扁桃酸消旋酶
南京理工大学
硕士
生物化工
李大力
2010
中文
TQ225.62
45
2010-10-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）