自养硝化细菌的分离、鉴定及norB基因工程菌的构建
自养型硝化细菌是参与生物脱氮过程中起硝化作用的主要菌群，其硝化速率直接影响污水处理系统的硝化效果和生物脱氮效率，是污水生物脱氮的限制性因素。本研究通过富集、分离纯化的方式筛选自养硝化细菌，采用传统微生物学方法和现代分子生物学手段对其鉴定，找到起硝化作用的norB基因，利用基因工程的手段构建高效硝化工程菌，旨在改变自养硝化细菌生长周期长，脱氮效率低的缺点。
自养硝化细菌的分离、鉴定及系统发育分析：以城市污水处理厂A2/O工艺中好氧活性污泥为菌源，筛选出两株自养型硝化细菌N3和N4。转接两株菌至液体分离培养基中培养14天，经检测，两株菌的硝化效果均可达100％。通过形态观察、生理生化实验初步鉴定表明，两株菌属于硝化杆菌属。利用分子生物学手段：DNA提取、PCR扩增、克隆、测序对菌株进一步鉴定，测序结果提交Genbank进行同源性检索，并通过MEGA软件进行比对和系统发育分析。16S rDNA序列分析表明这两株菌均属于硝化杆菌属，与维氏硝化细菌的同源性高达98％。
norB还原酶基因工程菌的构建：以N3为出发菌株，N3的基因组DNA为模板，根据N3的硝化还原酶norB操纵基因序列和质粒载体pET-28a的多克隆位点设计引物，PCR扩增得到norB基因。之后，经过EcoRI、HindⅢ双酶切，定向克隆到pET-28a载体上，化学转化至DH5a克隆菌感受态中，构建含有重组质粒的转化子pET-28a-norB。经酶切和测序鉴定，扩增产物的碱基序列与N3中norB操纵基因序列完全吻合。将重组质粒pET-28a-norB转化表达菌株BL21中，构建硝化基因工程菌pET-28a-norB-BL21(PNB)。采用用SDS-PAGE电泳验证norB还原酶在PNB是否成功表达，得到一条57KDa大小的蛋白条带，与预期大小一致。对重组基因工程菌PNB进行硝化效果测定，结果表明菌株PNB比菌株N3的硝化速率高12.7％。
自养硝化细菌;分离鉴定;norB基因工程菌;系统发育;基因克隆;污水生物脱氮
北京化工大学
硕士
环境科学与工程
胡翔;周岳溪
2010
中文
X703.1;Q93-331
70
2010-08-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）