酿酒酵母S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达研究
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是生物体内重要的中间代谢物质，参与了40多种生化反应，从基因的表达，细胞膜的流动到多肽的合成等等。临床研究表明，SAM对关节炎，抑郁症，肝功能紊乱等均有较好的疗效，而且还是预防癌症，心血管疾病和抗衰老的高级保健药物。我国肝炎患者相当多，且随着生活节奏的增快，抑郁症和关节炎患者也不断增多，S-腺苷甲硫氨酸在国内存在广阔的市场。而至今国内S-腺苷甲硫氨酸的研究还没有工业化，虽然有国外商品供应，但价格昂贵无法普及。因此国内开发高产廉价的S-腺苷甲硫氨酸生产工艺显得极为迫切。
本论文完成了酿酒酵母S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(sam2)的克隆及原核表达。以酿酒酵母2B-41的染色体DNA为模板，根据GenBank上登陆的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(登录号M23368)设计特异性引物进行PCR扩增，获得大约1200bp的DNA片段。通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆到pUCm-T载体中，构建重组质粒pUCm-T-sam2，转化E.coli DH5α，经蓝白斑筛选、菌落PCR及质粒的双酶切筛选出2个阳性克隆。选取一个阳性克隆测序，并用Blast软件进行序列分析。分析结果表明，该序列与Genbank中登录的sam2基因同源性为99％，氨基酸序列一致性为100％。
以EcoR I/XhoI双酶切经测序正确的重组质粒pUCm-T-sam2和表达载体pET-28a(+)，并将纯化后的sam2连接至pET-28a(+)，构建表达载体pET-sam2。将pET-sam2转化E.coli BL21(DE3)。重组菌经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳检测表达外源蛋白分子量约为47KD，与预期分子量相符。同时研究了不同IPTG浓度、不同诱导温度对蛋白表达水平的影响，发现IPTG浓度对SAM的表达量影响不大，低温不利于表达。测定酶活为0.0237U/mL。
酿酒酵母;S-腺苷甲硫氨酸;S-腺苷合成酶基因;基因克隆;基因表达;PCR扩增
北京化工大学
硕士
生物化工
王雅琴
2006
中文
TS261.11;Q785
65
2010-08-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）