柑桔溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体基因的构建及产物生物学特性研究
柑桔溃疡病(CBCD)是影响全球柑桔种植业发展的重大检疫性病害，其病原菌为地毯草黄单胞柑桔致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.citri)，是国内外重大检疫性有害生物。长期以来由于缺乏抗病品种和特效的化学防治药剂，对该病的防治主要采取加强非疫区建设与植物检疫来严防病害的传播，对罹病植株和种苗采取挖除并集中烧毁的根除措施。目前我国正在重庆三峡库区实施的柑桔非疫生产区建设，强化植物检疫，严防疫害传入的监控策略，迫切需要建立快速、特异、准确的诊断技术及防控措施。
基因工程重组单克隆抗体(recombination monoclonal antibody,RMA)是90年代以来，人们利用基因工程重组技术，有目的地在基因水平上对抗体分子进行切割、拼接或修饰，或者直接合成基因序列，再将重组DNA或重组蛋白基因导入细胞表达产生的一类抗体，兼具治疗和诊断双重功能。利用抗原-抗体特异性结合原理，可用于人类疾病、植物病害的诊断、治疗和预防。单链抗体(single chainvariable fragment，scFv)是利用基因工程的方法用一连接肽将抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)拼接在一起的重组蛋白，由于其低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强，成本低，可大规模生产等特点已广泛应用于医学领域。但是，但是scFv在很多情况下不稳定，容易聚集，难以获得足够量的高浓度抗体，因此制约了其在实际中的应用。而二硫键稳定Fv抗体(disulfide stabilized Fv fragments，dsFv)是通过在VH和VL之间引入一个二硫键取代连接肽而改造得到的一种抗体形式。由于二硫键是共价键，dsFv的两个结构域连接紧密不易解离，因此dsFv的稳定性与scFv相比有明显的提高，通常具有完整的抗原结合活性，甚至有时具有比scFv更高的亲和力。
本研究的目的就是针对柑桔溃疡病菌scFv抗体稳定性不好难以实际应用的缺陷，利用基因工程技术对其进行的稳定性改造。主要研究内容包括：通过重叠延伸PCR方法将半胱氨酸(cys)突变位点引入VH的44位和VL的100位，然后分别将其连接入pET30a(+)原核表达载体中，将pET30a(+)-VH和pET30a(+)-VL分别转化入表达菌株E.coli BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，表达产物主要以包涵体的形式存在。对表达产物进行复性、纯化并对其进行亲和力和稳定性进行分析。研究制备的新型抗体可望为柑桔溃疡病血清学诊断提供新型的诊断试剂，而且还可用于深入研究柑桔溃疡病菌与感病寄主的接触识别的侵入机理，为柑桔溃疡病与寄主相互作用研究提供一种新的手段。本研究已获得主要研究结果如下：
①通过重叠延伸PCR方法，以scFv基因为模板VH通过4轮PCR扩增，VL通过2轮PCR扩增，成功的将半胱氨酸突变位点引入VH的44位和VL的100位，测序结果表明基因序列正确。分别酶切后连接入表达载体pET30a(+)，并成功转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。
②对VH和VL进行IPTG诱导表达，表达产物绝大多数以包涵体的形式存在。SDS-PAGE分析表明VH和VL的大小均为23kd，与预期相符。Western-blot检测到目的条带说明表达产物正确。
③将表达的VH和VL包涵体分别用盐酸胍溶解后按摩尔比1∶1的比例混合稀释于复性缓冲液中复性后，非还原SDS-PAGE、还原性SDS-PAGE及western-blot分析表明VH与VL成功复性为Xac-dsFv，其大小为46kd。利用HisTrap HP柱对复性后的Xac-dsFv进行纯化，灰度分析表明其纯度达到83.27％。
④用BIAcore大分子相互作用仪对Xac-dsFv抗体的亲和力进行分析，结果表明Xac-dsFv对其抗原Xac的脂多糖LPS具有很高的亲和力，结合常数(ka)为5.48×108M-1s-1，解离常数(kd)为5.47×10-2s-1，亲和常数(KD)为9.98×10-10M。用Dot-blot和ELISA对Xac-dsFv的特异性进行检测，结果表明其对Xac具有较高的特异性，对其它10种对照细菌均无非特异性交叉反应。
⑤对复性Xac-dsFv抗体进行热稳定性检测。以Xac-scFv抗体为对照，检测Xac-dsFv抗体在PBS中，37℃孵育不同时间和相同的时间孵育在不同的温度中抗原结合活性的变化。结果表明，在37℃条件下，Xac-scFv24h后已经基本检测不到活性。Xac-dsFv在72h后仍然保持最初活性的61.3％。Xac-scFv在35℃孵育3h活性下降到最初的30.7％，在45℃时活性完全丧失，而Xac-dsFv在45℃仍具有52.6％的活性，55℃基本丧失活性。说明Xac-dsFv抗体的稳定性与Xac-scFv相比有了明显的提高，提高近20℃。
柑橘病害;柑桔溃疡病;果树检疫;微生物鉴定
重庆大学
硕士
微生物学
王中康
2009
中文
S436.661.1;Q93-331
52
2010-08-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）