EBV-LMP2的DNA疫苗、AAV疫苗以及腺病毒疫苗联合免疫效果的研究
Epstein-Barr(EB)病毒与多种人类的恶性肿瘤相关，鼻咽癌是其中之一，在我国南方一些省(自治区)发病率可高达10～50/10万/年，成为我国重点防治的十大肿瘤之一。虽然放疗及放疗联合化疗对很多病例有效，但仍有大约30％的病人难以控制。EBV在癌细胞中的存在为以CTL为基础进行鼻咽癌的免疫治疗提供了良好的靶位，成为传统治疗方法的有益补充。鼻咽癌的肿瘤细胞EBV处于Ⅱ型隐性感染状态，表达EBNAl,LMPl和LMP2蛋白。LMP2在肿瘤细胞中能稳定表达，无致癌性，具有潜在的HLA限制的细胞激活表位，能良好的诱导CTL发挥作用，成为公认的治疗NPC较理想的靶抗原。
本课题组在科室长期从事鼻咽癌的早期诊断及疫苗研究工作的基础上，致力于鼻咽癌的治疗性疫苗的研究。左建民等成功构建了携带EBV-LMP2基因的非复制5型重组腺病毒(rAd-LMP2)，该病毒可以在细胞内以内源蛋白的方式表达LMP2蛋白。王湛等对其进行了免疫效果研究，研究表明免疫恒河猴后能有效的诱导特异性CTL反应。腺病毒载体宿主范围广泛，对分裂期细胞、静止或终末分化细胞都有较高的转导效率，可在细胞内短期高水平表达目的基因，但腺病毒载体具有极高的免疫原性，免疫剂量及免疫次数增加都会显著增加腺病毒中和抗体的滴度，影响了目的基因的有效运输，对希望达到高效的免疫治疗效果会产生一定的影响。研究表明，用DNA疫苗或者一种载体疫苗初免后，用另一种载体疫苗加强免疫动物，与单一的疫苗免疫动物相比，能诱导更强的免疫应答。因此，我们拟构建另两种疫苗，DNA疫苗和重组腺相关病毒疫苗。DNA疫苗具有易于构建和改造、成本低廉、热稳定性好等优点，通过在体内表达目的抗原而引起特异性免疫反应，可以激发细胞免疫和体液免疫，尤其能更好的诱导特异性CTL。重组腺相关病毒(rAAV)载体宿主范围广，安全性好、物理性质稳定，具有极低的免疫原性和较长时期的基因表达能力，成为很有前景的用于疫苗的载体。鉴于以上背景，本研究在课题组以往从事的rAd-LMP2研究的基础上，制备DNA疫苗pVR-LMP2，重组腺相关病毒疫苗rAAV2/1-LMP2，几种疫苗联合应用，发挥各自的优势，以期达到单一疫苗难以达到的效果。
构建了DNA疫苗pVR-LMP2，酶切及测序结果表明LMP2基因正确插入pVR质粒载体中，间接免疫荧光实验及Western Blot法检测确认了LMP2在293细胞中能有效表达。
构建了重组AAV表达质粒pSNAV-LMP2，并建立了rAAV2/1-LMP2的生产细胞株BHK-LMP2，最终制备及纯化了AAV疫苗rAAV2/1-LMP2。电镜观察及SDS-PAGE分析显示我们得到了高纯度的重组病毒rAAV2/1-LMP2，感染性检测表明rAAV2/1-LMP2能感染293细胞并能有效表达LMP2蛋白。
将制备及纯化的pVR-LMP2、rAAV2/1-LMP2及本课题组已经制备好的rAd-LMP2，单独及几种联合免疫BalB/C小鼠，2周间隔，免疫三次，末次免疫后一周取脾淋巴细胞，IFN-γELISPOT检测特异CTL水平。结果表明pVR-LMP2、rAAV2/1-LMP2及rAd-LMP2单独免疫，组平均数分别为50个斑点形成细胞/106淋巴细胞、110个斑点形成细胞/106淋巴细胞、368个斑点形成细胞/106淋巴细胞，明显低于联合免疫组。在联合免疫组中，pVR-LMP2免疫两次，rAd-LMP2最后加强一次，组平均数为928个斑点形成细胞/106淋巴细胞，高于pVR-LMP2免疫一次，rAd-LMP2加强免疫两次组(组平均数为770个斑点形成细胞/106淋巴细胞)，可能是rAd-LMP2免疫一次后产生的腺病毒中和抗体封闭了再次的腺病毒载体，导致第二次的rAd-LMP2免疫不能很好的发挥作用。pVR-LMP2、rAAV2/1-LMP2和rAd-LMP2各免疫一次组的免疫效果最好，组平均数为1024个斑点形成细胞/106淋巴细胞，其中最高一只小鼠达到了1202个斑点形成细胞/106淋巴细胞。
总之，我们成功构建了DNA疫苗pVR-LMP2和重组腺相关病毒疫苗rAAV2/1-LMP2，两者都能够在小鼠体内诱发特异性CTL反应。pVR-LMP2、rAAV2/1-LMP2和rAd-LMP2三者联合免疫及pVR-LMP2免疫两次，rAd-LMP2最后加强一次能诱导更强的LMP2特异性CTL反应。
鼻咽肿瘤;免疫疗法;膜蛋白2;DNA疫苗
中国疾病预防控制中心
硕士
免疫学
周玲;莫武宁
2007
中文
R739.63;R730.51
58
2010-07-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）