离子束选育高产L-乳酸菌种及米根霉代谢调控的研究
本文根据育种理论和发酵工程理论，对L—乳酸生产菌种的选育、发酵法生产L—乳酸进行了系统的研究。采用离子束诱变育种技术，以突变株RE3303为出发菌株，在研究其菌种特性及其发酵工艺的基础上，获得耐高温菌株RF9052，该菌在15％的葡萄糖浓度，40～45℃温度条件下，36～40h产酸能力达到133～138g/L;为了更进一步降低成本，将碳源由葡萄糖改为玉米粉液化液，再利用离子束诱变育种技术，并最终筛选到乳酸生产能力和对糖转化率与原有菌株相比有较大幅度提高的高产菌株RLC41-6，该菌在15％的玉米液化液(以葡萄糖计算)浓度下，产酸能力达到138g/L，对糖转化率为92％，体积产酸速率达3.83g/(L·h)。主要研究内容如下：
⑴介绍了国内外乳酸生产和应用状况及离子束生物工程学的创立、发展和最新的研究动态。
⑵阐述了米根霉PW352和RE3303的发酵工艺，发酵产酸过程与产LDH之间的关系。根据两株菌的发酵产酸结果，选用RE3303作为耐高温菌以及高产糖化酶和高产L-乳酸菌的出发菌株。RE3303在40℃，15％的葡萄糖浓度下，产酸90 g/L，45℃产酸73 g/L；以12％玉米液化液(以葡萄糖计算)为碳源，36℃条件下发酵，产酸为90～93g/L。
⑶介绍了离子注入的能量、剂量等对米根霉存活率及突变率的影响，确定了合适的N+离子诱变参数：能量10～15keV，剂量40×2.6×1013ions/cm2～60×2.6×1013ions/cm2。总结了诱变筛选的工艺流程，考察了诱变筛选的方法，经过离子注入处理，筛选到耐高温菌株RF9052及糖化酶和L-乳酸高产的菌株RLC41-6,都具有很好的遗传稳定性。
⑷对菌株RF9052和RLC41-6的发酵工艺进行了优化。确定了其发酵产酸条件。RF9052在150g/L葡萄糖，(NH4)2SO43.0g/L，MgSO4·7H2O0.075g/L，ZnSO4·7H2O0.2g/L，KH2PO40.3g/L，CaCO370g/L的发酵培养基中，接种4mL的培养12小时的种子液，30mL/250mL装液量，在40～45℃，200r/min的条件下培养36～40h，产酸可维持与RE3303相当的水平，但最适发酵的温度范围则变为36～40℃。RLC41-6在150g/L玉米液化液(以葡萄糖计算)，(NH4)2SO41.5g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，ZnSO4·7H2O0.2g/L,KH2PO40.2g/L，CaCO370g/L的发酵培养基中，接种2mL培养6小时的种子液，在38℃，30mL/250mL装液量，200r/min的条件下培养34～36h，产酸可维持在133～138g/L之间，体积产酸速率为3.83g/L·h，较出发菌株产酸提高了53％。
⑸对玉米粉的处理方法做了研究，得出经过液化的培养基有利于发酵和加速产酸的过程，不经液化的发酵液粘稠影响氧和营养物质的传递和吸收，产酸慢，即使加入糖化酶与米根霉产生的糖化酶一同水解淀粉分子，也不能明显地提高产酸速率。
⑹介绍了发酵液中的无机盐离子对发酵产酸的影响，得出合适的无机盐可以抑制杂酸的产生，促进乳酸的生成，使生成的乳酸达到很高的纯度。KH2PO4浓度在0.3～0.4％，MgSO4浓度在0.075～0.125％，ZnSO4浓度在0.015～0.02％的范围内，富马酸等杂酸基本被抑制，发酵的过程沿着产L-乳酸的方向。
⑺通过对PW352，RE3303，RF9052，RLC41-6四株菌产酸过程与分泌乳酸脱氢酶过程关系的研究，得出在离子束诱变米根霉筛选高产L-乳酸菌种的过程中，LDH活性与L-乳酸的生成成正相关性。经离子束修饰的米根霉菌株RE3303，RF9052，RLC41-6，与原始出发菌株相比，生成乳酸的关键节点——丙酮酸代谢节点以及关键酶——乳酸脱氢酶发生了变化。从LDH对底物Km值的变化，说明由于离子束的修饰作用，使得修饰后的菌株对辅酶NADH的依赖性降低，而对底物丙酮酸的亲和力增加，这与被离子束修饰后的菌株产酸能力增强的结果是一致的。从LDH同工酶的变化来看，由于离子束的修饰作用，使得LDH在分子水平上发生了变异，这可能是为了更适应有利于L-乳酸生成的代谢过程而引起的一种分子进化。
L-乳酸
中国科学院合肥物质科学研究院
博士
核能科学与工程
余增亮
2006
中文
TQ920.1;TQ921.3;Q691
99
2011-05-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）