植物DREB抗逆转录因子dsDNA芯片研究
植物的抗胁迫(干旱、盐碱、寒冷)功能是多种基因控制的综合反应，过去的抗逆基因工程研究一直停留在某一个或几个基因上，对基因的表达、结构和与其相关基因调控机制缺乏详细的研究。一个植物抗逆转录因子(如DREB)可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐受性有关的功能基因的表达。双链DNA芯片(dsDNA，double strand DNA)能够非常有效地检测基因表达调控中序列特异性DNA(顺式作用元件)和蛋白质(转录因子)的相互作用，因此，本研究提出制备双链DNA微阵列芯片，从蛋白质编码基因的调节区着手，研究抗逆转录因子作用机理。
在本研究中，以拟南芥为材料，以干旱、盐碱、寒冷等逆境胁迫相关的AP2/EREBP家族的DREB子家族转录因子DREB1A、DREB2A为研究靶点，通过PCR和RT-RCR扩增得到抗逆转录因子DREB1A、DREB2A基因，将其分别克隆到PUCm-T载体中，序列分析表明获得的基因序列与已报道的该基因序列完全相同。将克隆的目的基因与表达载体PET-28a(+)连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)和RosettaTM(DE3)，DREB1A蛋白得到了成功表达，而DREB2A未表达。利用His-Tag纯化柱在AKTATM纯化仪对目的蛋白进行纯化，获得了DREB1A蛋白。
同时，对双链DNA芯片的制备方法做了初步的探讨。用Taq DNA聚合酶代替了价格昂贵的Klenow DNA聚合酶，并对Taq DNA聚合酶在片延伸体系的反应温度，Mg2+浓度以及单链探针的变性、不变性等条件进行了优化。发现利用Taq DNA聚合酶在片延伸制备双链DNA芯片时，延伸温度50℃效果较好，Mg2+浓度2.5mM效果明显好于1.5mM；单链不变性效果优于变性处理。优化方法制备的双链DNA芯片将更有利于DRE顺式作用元件与表达的DREB抗逆转录因子蛋白相互作用的研究。
植物抗胁
中国科学院寒区旱区环境与工程研究所
硕士
生态学
谢忠奎
2007
中文
Q949.748.3
59
2011-05-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）