单链抗体、RGD与力达霉素在链霉菌中的融合表达研究暨多靶点RNA联合干扰在肿瘤治疗中的应用研究
本研究分为二部分：
第一部分：单链抗体、RGD与力达霉素在链霉菌中的融合表达研究
力达霉素(Lidamycin，LDM)是由球孢链霉菌C-1027(Streptomyces globisporus C-1027)产生的抗肿瘤抗生素。LDM分子由两部分组成:一为烯二炔结构的发色团(Lida-chromophore，LDC)，具有极强的细胞毒作用但不稳定；一为110个氨基酸残基组成的辅基蛋白(Lida-protein，LDP)，对LDC的稳定起保护作用。发色团与辅基蛋白以非共价键结合，其结合具有特异性和稳定性。LDM生物合成基因簇包括约75kbDNA中的56个开放阅读框(ORF)，其中辅LDP编码基因cagA位于ORFA1与ORFA4之间。
单克隆抗体与化疗药物偶联物是肿瘤靶向治疗药物的一个重要分支。特定的化疗药物与不同抗体偶联可以作为一种技术平台制备系列化的抗体药物。抗IV型胶原酶单抗及其单链抗体(single-chain Fvfragment，scFv)可以有效地抑制肿瘤细胞的生长。LDM是迄今已报道的对肿瘤细胞具有最强杀伤作用的抗肿瘤抗生素，可以作为单抗导向药物的“弹头”。本实验室已将LDP与抗IV型胶原酶scFv在大肠杆菌中成功进行融合并表达scFv-LDP，再装配LDC，形成scFv-LDM融合蛋白。本研究尝试以LDM原产生菌S.globisporusC-1027为基础，通过遗传重组构建能稳定表达并分泌scFv-LDM的链霉菌重组菌株。其策略是利用同源双交换的方法，用cagA-scFv基因序列取代LDM生物合成基因簇中LDP编码基因cagA，不改变LDM生物合成基因簇其他组分的编码基因。
首先使用PfuDNA聚合酶，以S.globisporus C-1027的总DNA为模板进行PCR反应，在辅基蛋白基因cagA终止密码子TGA两侧扩增出用于双交换的两臂--E臂和G臂；以含有scFv基因的pEFL质粒为模板，扩增scFv基因；从质粒pUO9090中酶切得到阿普霉素抗性基因片段。将上述4个片段连入带有硫链丝菌素抗性基因(tsr)，且可用于接合转移的大肠杆菌菌一链霉菌穿梭质粒pBS03，最终得到用于同源双交换的含融合蛋白编码基因cagA-scFv的质粒pBS-scFv。scFv基因序列连接在cagA的C末端终止密码子之前，为了保持两个基因编码蛋白质的生物活性，在两个基因之间用编码GGGGS五肽的DNA序列连接。用构建好的质粒pBS-scFv转化大肠杆菌ET12567，通过接合转移转入S。globisporusC-1027中，筛选有阿普霉素抗性而对硫链丝菌素敏感(AmrThioss)的转化子，即可能为发生双交换的重组菌株。
对重组菌株进行PCR扩增并对产物进行测序，Southernblot对重组菌株进行验证。结果显示，重组菌株S.globisporusC-1027-scFv构建完全正确，LDM生物合成基因簇中的LDP编码基因cagA已经被融合蛋白编码基因cagA-scFv序列所取代。构建成功的重组菌株被命名为S.globisporusC-1027-scFv。
由于LDM的抗肿瘤活性和抑菌活性相互平行，本研究用抑菌活性来代替抗肿瘤活性。结果显示，重组菌株S.globisporusC-1027-scFv发酵产物具有抑菌活性。使用C1培养基对重组菌株不同发酵时间点的发酵液抑菌活性进行检测，结果发酵60小时后抑菌活性开始出现，随发酵时间延长活性逐渐增加，84小时达到顶峰，108小时后活性消失。
SDS-PAGE分析显示，重组菌株S.globisporusC-1027-scFv不再产生LDM条带。然而，检测到一条新蛋白条带，相对分子质量约38000道尔顿，位置与scFv-LDM融合蛋白分子量相对应，而S.globisporusC-1027菌株中没有检测到该条带。根据以上结果，推测该新蛋白条带为scFv-LDM融合蛋白表达条带。
ELISA方法检测了重组菌株发酵液抗IV型胶原酶的免疫活性，结果表明重组菌株发酵液具有IV型胶原酶结合活性。对活性发酵液样品进行Westernblot检测，结果显示重组菌株发酵液在scFv-LDM融合蛋白位置显色，进一步证实发酵液中含有scFv-LDM融合蛋白。
RGD三肽特异性与αvβ3整合素结合，而αvβ3整合素在很多肿瘤组织中高表达，与肿瘤的血管形成高度相关。为了构建力达霉素融合蛋白表达技术平台，我们还开展了RGD-LDM融合蛋白的研究工作。根据含RGD十肽ACRGDMFGCA的氨酸酸序列和链霉菌偏好密码子，合成十肽(tenpeptide，tenp)基因序列，连接到cagA的C末端，构建了含cagA-tenp基因序列可用于同源双交换的质粒pBSten。测序鉴定正确的质粒pBSten经接合转整合到S.globisporus C-1027基因组中，根据抗性差异挑取重组子，进行PCR验证和Southernblot验证。验证正确的菌株命名为S.globisporus C-1027-tenp，抑菌圈检测显示重组菌株发酵液具有抑菌活性。
综上所述，我们成功构建了重组菌株S.globisporusC-1027-scFv和S。globisporusC-1027-tenp，重组菌株S.globisporusC-1027-scFv可以产生并分泌scFv-LDM，但该重组菌株scFv-LDM的产率有待进一步提高。本研究为力达霉素融合蛋白表达技术平台的建立打下了良好的基础。
第二部分：多靶点RNA联合干扰在肿瘤治疗中的应用研究
RNA干扰技术是一种非常有潜力的肿瘤基因治疗手段，目前用于治疗研究的RNA干扰剂主要有化学合成小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)和短发夹RNA(shorthairpin RNA，shRNA)表达载体。为了实现多基因联合干扰，实验设计并构建了一个能同时表达多种shRNA的质粒pCSH1。其优点是分子量小，可以同时携带多个shRNA转录单位，使DNA转染时只需要较小的量就可以实现有效的RNA干扰作用，从而实现多个基因的联合抑制。
癌基因N-ras和c-Myc经常在肿瘤细胞中过表达或突变。在人肝癌HepG2细胞中，N-ras和c-Myc同时异常表达。本研究以N-ras和c-Myc为靶点，将该基因中的shRNA模板序列串联构建到载体pCSH1中，构建了能表达N-rasshRNA和c-MycshRNA的双干扰载体pCSH1-NM，使该载体在导入HepG2细胞后即可同时抑制两个基因的表达。
以对照载体pCSH1-mock、N-ras干扰载体pCSH1-Nras、c-Myc干扰载体pCSH1-cMyc和双干扰载体pCSH1-NM分别转染HepG2细胞，进行RT-PCR和Westernblot检测。结果表明，双干扰载体能同时抑制两个基因的表达，每个基因的干扰都达到和单基因干扰载体同样的抑制效果。
生长抑制实验结果表明，同时干扰N-ras和c-Myc对细胞生长抑制作用强于单独干扰N-ras或c-Myc。Hochest染色结果显示，经过pCSH1-NM质粒瞬时转染处理后，凋亡细胞比例增加，凋亡细胞百分比明显高于N-ras或c-Myc单独干扰组。结果提示同时干扰N-ras和c-Myc能明显增强凋亡诱导作用。pCSH1-Mock转染组和空白对照组结果基本一致，且细胞密度明显高于pCSH1-Nras或pCSH1-cMyc单独转染组以及pCSH1-NM转染组。这些结果说明，人肝癌HepG2细胞凋亡主要是由N-ras或(和)c-Myc基因抑制引起的。
基因芯片分析结果表明，N-ras单基因干扰引起的基因变化(显著升高或降低)数明显高于c-Myc单基因干扰引起的基因表达变化数。N-ras与c-Myc双干扰引起的基因表达变化数介于二者之间。3个促凋亡基因TSC22，GMF和NRIF3在pCSHl-NM组与pCSHI-cMyc同时上调，说明N-ras和c-Myc基因可促进HepG2细胞调亡。
综上所述，HepG2细胞中异常表达的N-ras和c-Myc可以通过RNA干扰手段同时抑制，且N-ras和c-Myc双基因干扰比N-ras或c-Myc单基因干扰在抑制细胞生长和促进HepG2细胞凋亡方面更为有效。RNA干扰介导的多靶点基因治疗有望成为一种有效的肿瘤治疗手段。
力达霉素;单链抗体;抗肿瘤活性;抑菌活性;重组菌株发酵液;融合蛋白;RNA干扰介导;基因治疗
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
微生物与生化药学
邵荣光;洪斌
2008
中文
R979.14
96
2010-05-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）