硝克柳胺防治糖尿病并发症作用机制研究
糖尿病慢性并发症，是糖尿病致死致残的主要原因。糖代谢异常导致血管、神经以及组织器官的损伤。微血管并发症有糖尿病眼病、糖尿病肾病等；大血管并发症有冠心病、脑中风、糖尿病坏疽等；糖尿病神经并发症包括感觉神经、运动神经及植物神经异常等。糖尿病并发症的主要发病机制有醛糖还原酶活性增强、糖基化终末产物(AGE)形成增多、PKC活性增加以及氧化应激。硝克柳胺是中国医学科学院药物研究所研究开发的1.1类化学药品，己申请中国和国际化合物发明专利。在大鼠顺铂急性肾损伤模型、大鼠5/6肾切除模型、链脲霉素(STZ)致大鼠糖尿病肾病模型以及遗传性高血压大鼠(SHR)肾损伤模型的研究，均被证明具有明显的肾功能保护作用。本论文在动物体内、分子和细胞水平，从糖尿病并发症发病的共同机制AGE和醛糖还原酶，以及糖尿病肾病相关的致纤维化因子TGF-β1、CTGF的表达和基质金属蛋白酶(MMPs)活性等方面，探讨硝克柳胺防治糖尿病并发症的作用机制，为这类药物的进一步开发与应用奠定基础。
首先在大鼠STZ糖尿病模型观察了硝克柳胺的防治糖尿病并发症的作用。实验设正常组、模型组、阳性药氯沙坦10mg/kg治疗组、硝克柳胺7.5、15及30mg/kg三个剂量治疗组。每周测体重、血糖，统计白内障发生率。于药物治疗8、12、16及20周，测定大鼠血生化指标及尿白蛋白。于治疗20周时，处死动物，取心脏、主动脉及肾脏做病理学检查，免疫组化检测主动脉及肾脏组织糖基化产物CML的表达，检测肾脏致纤维化因子TGF-β1、CTGF及胞外基质成分FN及ColIV水平。
实验结果显示，硝克柳胺本身不影响血糖水平，对糖尿病大鼠的糖尿病并发症症状有缓解作用。糖尿病模型组大鼠体重增长较正常大鼠缓慢；硝克柳胺治疗组大鼠体重较正常大鼠下降，但平均体重明显高于模型组。糖尿病模型组大鼠在造模后6周出现白内障，至实验结束(造模后20周)时白内障发生率达80％。硝克柳胺治疗组大鼠在造模后8周发生白内障，至实验结束时，30mg/kg治疗组的白内障发病率仅为37.5％，明显低于模型组。糖尿病模型组大鼠在造模后8周即出现高血脂症状，甘油三酯水平升高近1倍，胆固醇水平升高约30％；硝克柳胺治疗组大鼠血中甘油三酯及胆固醇水平均低于模型组，30mg/kg治疗组血脂水平接近正常。糖尿病模型组大鼠在造模后8周出现肾功能障碍，表现为血尿素氮(BUN)升高、白蛋白尿症状；造模后20周病理学检查显示，肾脏肥大、肾小球硬化、系膜区扩张、基底膜增厚以及肾小管上皮细胞空泡变性。硝克柳胺30mg/kg治疗组大鼠的肾功能指标BUN及24hr白蛋白排出量(UAE)明显低于模型组，肾组织病理损伤程度也比模型组轻，与阳性药氯沙坦效果相当。结果表明，硝克柳胺有效缓解了糖尿病大鼠的体重降低；延缓了糖尿病白内障的发生，并且降低白内障发生率；有效纠正了糖尿病大鼠的高血脂症状；对糖尿病肾脏病理损害有保护作用，明显改善了糖尿病大鼠受损的肾功能。
AGE是糖尿病慢性并发症主要发病机制之一。AGE除了直接的损害作用，还通过与AGE受体(RAGE)相互作用，诱导特异的细胞免疫应答，诱导TGF-β1、CTGF等致纤维化因子高表达。免疫组化结果显示，糖尿病模型组大鼠主动脉壁和肾组织中CML-AGE水平升高，而在硝克柳胺治疗组大鼠主动脉壁和肾组织中表达较低；TGF-β1、CTGF以及胞外基质成分FN、ColIV在模型组大鼠肾组织中表达均比正常大鼠高，硝克柳胺治疗组大鼠肾组织中表达均较低。
为了研究硝克柳胺的抗AGE形成与交联作用，在体外建立了AGE形成体系，采用荧光检测法、ELISA方法以及圆二色谱法，观察硝克柳胺的抗AGE形成作用；在体外葡萄糖和核糖介导的溶菌酶蛋白分子糖基化交联体系，通过SDS-PAGE凝胶电泳检测硝克柳胺的抗交联作用。
50mg/ml牛血清白蛋白及0.5mMD-葡萄糖在37℃暗处反应一定时间，可检测到AGE特征荧光值(Em370nm，E×440nm)，在SDS-PAGE凝胶电泳图上可见到分子量增加的糖基化BSA条带，提示50mg/ml牛血清白蛋白与0.5mMD-葡萄糖在37℃暗反应条件下可形成BSA糖基化产物。硝克柳胺以及硝克柳胺与BSA共孵育产物，对AGE的荧光检测无干扰。在BSA-葡萄糖AGE形成体系，200μM硝克柳胺及其水溶性钾盐均能抑制AGE荧光值增加，对AGE非荧光产物CML-BSA形成也有抑制作用，与同剂量的阳性药氨基胍(AG)相比作用强度相似。BSA在圆二色谱表现为特异负吸收双峰，BSA-葡萄糖糖基化产物在圆二色谱表现为特异负双峰减弱变平坦，而水溶性硝克柳胺钾盐能够抑制这种变化趋势，与其抑制BSA糖基化有关。
明胶是细胞外基质的主要成分，核糖是还原性较强的五碳糖。在BSA/明胶与葡萄糖或核糖的反应体系，BSA和明胶更容易被核糖糖基化。在体外两种蛋白与两种糖的AGE形成体系，硝克柳胺均明显抑制AGE荧光值的增长。
在体外蛋白质与还原糖的反应体系中，经过一段反应时间，可以产生蛋白分子链间交联，在SDS-PAGE凝胶电泳图谱上表现为单分子量、2倍分子量及多倍分子量的蛋白条带。在溶菌酶与葡萄糖及核糖反应体系中，核糖比葡萄糖更容易介导蛋白交联。硝克柳胺及其钾盐明显抑制了葡萄糖及核糖介导的溶菌酶蛋白分子间的交联。
上述结果表明，硝克柳胺及其钾盐对荧光AGE及非荧光AGE的形成均具有明显的抑制作用；对糖基化蛋白交联反应，硝克柳胺也表现了较强的抗交联作用。
多元醇通路增强也是糖尿病并发症的主要发病机制之一。高血糖时，醛糖还原酶被激活造成细胞内山梨醇大量堆积，引发一系列病理改变，从而诱发白内障、视网膜病变、神经病变、肾脏病变等糖尿病并发症。硝克柳胺对大鼠晶状体醛糖还原酶的活性有较强的抑制作用，IC50在0.7μM左右。
为进一步研究硝克柳胺防治糖尿病肾病的作用机制，在细胞水平观察了AGE及高糖对原代培养的大鼠肾系膜细胞rMC及人肾小管上皮细胞系HKC细胞周期的影响，对rMCTGF-β1及CTGF基因表达的影响以及对细胞分泌的基质金属蛋白酶(MMPs)活性的影响。
流式细胞术的结果显示，硝克柳胺本身不影响rMC及HKC的细胞周期分布。0.1mg/mlAGE及25mM葡萄糖对rMC作用24hr后，细胞周期改变均表现为:G1期细胞比例增加，S期细胞下降；硝克柳胺能干预AGE引起的rMC细胞周期改变，但几乎不影响高糖诱导的细胞周期变化。在HKC细胞，AGE作用24hr后细胞周期改变表现为G1期细胞比例明显增加，S期细胞比例明显下降；硝克柳胺能抑制AGE引起的G1期增多及S期减少。25mM葡萄糖及5ng/mlTGF-β1对HKC细胞周期的影响均为G1期阻滞，硝克柳胺未能缓解高糖及TGF-β1引起的HKC细胞周期改变。
AGE使rMC细胞TGF-β1及CTGF基因表达增加，分泌到细胞外液中的TGF-β1及CTGF增多。硝克柳胺对AGE诱导的TGF-β1及CTGF基因表达及分泌增加均有干预作用。高糖也导致rMC细胞分泌到细胞外液中TGF-β1及CTGF的增多，硝克柳胺对高糖诱导的TGF-β1及CTGF分泌增加干预作用较弱。说明硝克柳胺通过干预AGE的作用，使过表达的TGF-β1及aGF降低，进而抑制了AGE对细胞周期的影响。
AGE使rMC及HT1080分泌的基质金属蛋白酶MMP2及MMP9的活性降低，硝克柳胺能够部分恢复MMPs的活性。
以上结果提示，硝克柳胺对AGE及高糖诱导的细胞G1期增多、TGF-β1及CTGF高表达以及MMPs活性降低均有干预作用。
综上所述，硝克柳胺防治糖尿病并发症的作用机制在于:抑制AGE形成，抗AGE交联，抑制醛糖还原酶活性；硝克柳胺抗糖尿病肾病的作用机制，还与抑制AGE引起的细胞周期改变、TGF-β1及CTGF高表达以及MMPs活性降低有关。
顺铂为金属铂类络合物，抗癌谱广，是临床化疗一线药。但对肾、神经系统及胰腺有毒性。最常见最严重的毒性是由于直接对肾小管的损伤作用而引起的肾功能损害，顺铂的肾毒性是其剂量限制性毒性。本实验室以往研究表明，硝克柳胺对顺铂所致大鼠肾功能损伤有保护作用，但对肝肾组织升高的脂质过氧化水平无影响，体外实验也未观察到抗氧化活性。提示硝克柳胺抗顺铂肾毒性作用存在其它机制。
顺铂的肾毒性主要是肾小管上皮细胞损伤。采用MTT方法、生长曲线法及流式细胞术，观察到顺铂抑制人肾小管上皮细胞HKC的增殖，将其阻滞在S期，对HKC有直接的毒性作用:硝克柳胺与顺铂合用时，抑制了顺铂的细胞毒作用。
顺铂的抗肿瘤机制及其肾细胞毒性机制在于其与DNA碱基的结合，引起DNA交联而改变构象。DNA构象的改变在圆二色谱表现为峰型的改变。顺铂与DNA分子中相邻两个碱基结合后，改变碱基相互旋转角度，破坏了碱基堆积规律，导致碱基间相互作用减小，使CD峰值降低，峰位红移。当体系中含有EDTA时，EDTA与顺铂螯合，使顺铂不能与DNA碱基结合，因此DNA的CD峰谱几乎没有变化。当体系中含有0.8μM硝克柳胺，DNA、顺铂、硝克柳胺分子比为1:2:8时，硝克柳胺抑制了顺铂DNACD峰谱的改变。提示硝克柳胺可能通过螯合顺铂分子，干扰其与DNA结合而发挥作用。
已知AGE形成和交联过程都需要金属离子参与，硝克柳胺的金属螯合作用可能是其抗AGE形成和交联的主要机制之一。
硝克柳胺;糖尿病并发症;终末糖基化产物;醛糖还原酶;发病机制;病理损害
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
药理学
陈晓光
2008
中文
R965;R587.2
123
2010-05-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）