猪繁殖与呼吸综合征荧光定量PCR检测方法建立及其应用
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）以母猪发热、厌食、流产、死胎、产木乃伊胎和弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征，由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起，给全球养猪业造成相当严重的经济损失，目前对于本病尚无有效的药物进行治疗，主要依靠疫苗预防接种。因此利用体外增殖该病毒及研究其在猪体内的增殖规律显的尤为重要。本研究建立了检测与诊断猪繁殖与呼吸综合征PCR方法及同时研究在Marc-145细胞中的增殖规律和在猪体内的增殖规律及分布，旨在为PRRSV的流行病学、疫病预防等相关领域的研究提供依据。主要研究内容如下：
（一）设计并合成一对特异性引物，通过从病料中提取总RNA并逆转录为cDNA，PCR扩增，产物纯化后与pGEM-T-easy载体连接，转化大肠杆菌JM109，筛选后得到重组标准品质粒，作为模板，且对反应的退火温度、引物浓度等进行优化，然后以优化的条件建立一种能够快速、灵敏地检测PRRSV的SYBR-Green1实时荧光定量PCR诊断方法。结果显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系，线性范围广，17～36个循环都能测出；稳定性、重复性好。用该方法对3份不同的组织样品进行了重复检测，结果表明，该方法具有良好的重复性，可满足当前PRRS的诊断需要.
（二）猪繁殖与呼吸综合征病毒，可以在原代猪肺泡巨噬细胞（PAM）、CL2621细胞系及Marc-145细胞系上生长繁殖，但引起细胞病变不明显，对于其增殖规律不甚了解。本试验采用实时荧光定量PCR技术，研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞中的增殖规律；结果显示病毒在接种后12h开始大量增殖，在18-36h增殖最为迅速，在36-48h达到病毒增殖最高峰；该结果为疫苗生产提供了试验基础，同时也为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒病理学研究提供了试验基础。
（三）猪繁殖与呼吸综合征感染的特点之一是持续性感染和病毒血症。本研究应用建立的荧光定量PCR（FQ-PCR）检测PRRSV的方法，检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）弱毒疫苗人工感染断奶前后的仔猪后备器官不同时间段的病毒含量，结果表明：在攻毒12h后能从消化系统及血液、心脏和肝脏中检测到病毒RNA；病毒RNA的含量在48h后达到最高峰，并一直维持到96h。随后各待检脏器中病毒RNA含量持续降低，但在168h后仍能从粪便、肝脏和脾脏中检测到少量的病毒RNA。本试验为阐明PRRSV的致病机理及防控提供了重要的试验数据和理论依据。
猪繁殖与呼吸综合征病毒;荧光定量PCR;增殖规律;人工感染
河南农业大学
硕士
兽医学
魏战勇
2009
中文
S858.28
50
2010-03-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）