旋毛虫成虫抗原的研究
1．研究目的
研究大理猪源旋毛虫成虫（Trichinela spiralis adult worm）三种抗原：排泄分泌抗原（ES）、表面抗原（SA）和虫体可溶性抗原（BSA）的蛋白组分及其之间的差异，并进一步分析其免疫反应性，为分离和筛选出免疫原性和免疫反应性强的旋毛虫成虫抗原成分打基础。由于旋毛虫成虫是旋毛虫感染的早期阶段，肠道是其寄生场所，因此成虫抗原成分可能作为旋毛虫病口服疫苗的候选抗原成分，将对旋毛虫病早期免疫预防和免疫诊断具有实践意义。
2．研究方法
2．1改良贝氏法收集旋毛虫成虫
2．2旋毛虫成虫抗原制备:将旋毛虫成虫在不含血清的RPMI—1640培养基中于5%CO2培养箱中37℃培养24h，离心、收集上清、透析、浓缩后得到排泄分泌抗原（ES）；将旋毛虫成虫在含0．25%十六烷基三甲溴化铵（CTAB）及2%脱氧胆酸钠的RPMI—1640培养基中37℃孵育2．5h，其间摇动培养瓶1次，离心、收集上清、透析、浓缩得到表面抗原（SA）；将旋毛虫成虫反复冻融、研磨、超声粉碎、冷浸、离心，得到虫体可溶性抗原（BSA）。
2．3制备免疫血清并检测
2．3．1阴性血清的制备:SD大鼠感染旋毛虫幼虫前尾静脉采血，获得阴性血清。
2．3．2大鼠抗旋毛虫血清:用旋毛虫肌肉幼虫经口感染SD大鼠（8×103条/只），6周后，尾静脉取血，用旋毛虫IgG抗体检测试剂盒检测感染旋毛虫大鼠血清IgG抗体效价，严格按试剂盒说明书操作，检测得大鼠血清IgG抗体效价高达1：10240，即可于乙醚麻醉下经股动脉取血，室温静置30min，3×103r/min离心5min，取上清液即为大鼠抗旋毛虫血清。分装，于—20℃冰箱保存备用。
2．4旋毛虫成虫三种抗原的分析以大理猪源旋毛虫肌肉幼虫的三种抗原（排泄分泌抗原、表面抗原和虫体可溶性抗原）作对照，采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE），分别对成虫三种抗原蛋白成分进行分析；采用蛋白印迹（Western—blot）对成虫抗原进行免疫反应性分析。
3.结果
3．1旋毛虫肌幼虫和成虫体外培养和收集结果本研究选择10只成年SD雌性大鼠经口食入含约500条旋毛虫肌肉幼虫的小鼠肌肉，收集旋毛虫肌幼虫40万条（见图1）。然后选择30只成年SD雌性大鼠，每只大鼠经口感染8000条旋毛虫肌肉幼虫，收集纯净成虫10万条，发现收集的成虫中雌虫子宫内充满新生幼虫，而且培养液中已有一定新生幼虫。另外培养液中仍有一定量的雄虫，表明雄虫交配后并未很快死亡（见图2）。
3．2旋毛虫成虫抗原的SDS—PAGE分析结果以旋毛虫肌幼虫排泄分泌抗原、表面抗原和虫体可溶性抗原作对照，对旋毛虫成虫排泄分泌抗原、表面抗原和虫体可溶性抗原经SDS—PAGE分析和考马斯亮蓝R—250染色后，可见旋毛虫成虫可溶性抗原显示29条蛋白染色条带，分子量范围在112kDa—10kDa之间，其中主带13条，分子量分别为100、95、81、50、45、43、37、35、30、27、24、20、10kDa；旋毛虫肌幼虫虫体可溶性抗原显示30条蛋白染色条带，分子量范围在100kDa—12kDa之间，其中主带11条，分子量分别为100、66、63、55、45、40、37、35、30、16、12kDa；旋毛虫成虫表面抗原显示4条主要蛋白染色条带，分子量分别为50、48、40、34kDa；旋毛虫肌幼虫表面抗原显示10条主要蛋白染色条带，分子量范围在105—28kDa之间，分子量分别为105、99、80、63、55、48、35、28、24、21kDa。旋毛虫成虫排泄分泌抗原显示17条蛋白染色条带，分子量范围在120—14kDa之间，其中主带6条，分子量分别为120、64、43、40、35、33kDa；旋毛虫肌幼虫排泄分泌抗原显示20条蛋白染色条带，分子量范围在112—10kDa之间，其中主带11条，分子量分别为112、66、56、55、53、49、45、43、25、21、10kDa（见图3）
3．3．3旋毛虫成虫抗原Western—blot检测结果Western—blot检测结果表明，以大鼠抗旋毛虫血清检测时，旋毛虫成虫虫体可溶性抗原可出现13条反应条带，其中分子量为81、40、37、33、30kDa的条带着色明显；旋毛虫肌肉幼虫虫体可溶性抗原可出现25条反应条带，分子量范围在80—10kDa之间，其中分子量为75、66、63、55、49、45、37、28、20、16kDa的条带着色较深；旋毛虫成虫表面抗原出现4条反应条带，其分子量分别为50、48、40、34kDa；旋毛虫肌幼虫表面抗原出现7条反应条带，分子量分别为105、99、80、55、48、35、28kDa，其中48、35kDa显色明显；旋毛虫成虫排泄分泌抗原显示7条反应带，其分子量分别为43、40、35、27、19、18、14kDa，其中43、40、27、18kDa着色明显；旋毛虫肌幼虫排泄分泌抗原显示14条反应带，其分子量范围在74—12kDa之间，其中53、49、45、43、35、27、18、12kDa显色明显（见图4）。而阴性血清在相应位置均无特异性反应条带出现。
4.结论
4．1．旋毛虫成虫虫体可溶性抗原和肌幼虫虫体可溶性抗原都含有分子量为45、37、35、30kDa的蛋白组分；旋毛虫成虫虫体可溶性抗原中分子量为81、40、37、33、30kDa的蛋白组分能与大鼠抗旋毛虫血清抗体IgG发生较强的特异性识别。
4．2．旋毛虫成虫表面抗原与肌幼虫表面抗原都含有分子量为48kDa的蛋白组分；而且成虫表面抗原中分子量为50、48、40、34kDa的蛋白组分能与大鼠抗旋毛虫血清抗体IgG发生较强的特异性识别。
4．3．旋毛虫成虫排泄分泌抗原中含有分子量分别为120、64、43、40、35、33kDa的主要蛋白组分；旋毛虫成虫排泄分泌抗原中分子量为43、40、35、27、19、18、14 kDa蛋白组分能与大鼠抗旋毛虫血清抗体IgG发生较强的特异性识别。
旋毛虫;表面抗原;可溶性抗原;排泄分泌抗原;免疫诊断
大理学院
硕士
病原生物学
申丽洁
2009
中文
R383.15
50
2010-01-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）