重组人DNaseⅠ在大肠杆菌中的表达与分离纯化
DNase I是发现最早的一种特异性DNA水解酶，在Ca2+和Mg2+等二价金属离子存在的中性pH值条件下水解双链DNA生成5’磷酸末端和3’羟基末端的寡核苷酸。DNaseⅠ在发现伊始仅被单纯的视为一种消化酶，参与食物来源DNA的降解。随着研究的深入，发现DNaseⅠ与细胞凋亡、细胞坏死染色质降解及系统性红斑狼疮、胃肠道肿瘤和心肌梗死发生密切相关。本实验利用聚合酶链式反应克隆人DNaseⅠ基因，并在大肠杆菌中进行表达。主要研究内容如下：
⑴选用大肠杆菌的偏爱密码子化学合成人DNaseⅠ基因，在其5’端和3’端分别引入BamH I和Sac I位点。此基因先连入克隆载体pGEM-T，测序正确后，再连入pET-22b（+）表达载体构建重组表达载体pET-22b-hDNASE。将构建的载体质粒转化大肠杆菌Rosettatm（DE3），筛选阳性克隆即获得基因工程菌。
⑵研究了此基因工程菌在不同诱导温度、不同诱导时间、不同IPTG浓度，不同氨苄浓度和不同pH值对融合蛋白表达的影响，结果表明，诱导温度37℃时蛋白表达量最高，随时间的增加蛋白表达逐渐增加，3h融合蛋白表达量占细菌总蛋白的52．6%；当IPTG浓度为0．5mmol/L时蛋白表达量最高；氨苄浓度的变化对融合蛋白表达无显著影响；pH值为中性时最高。
⑶融合蛋白在细胞内的分布与培养条件相关。当37℃诱导时，融合蛋白主要以包涵体形式存在；而用LB培养，20℃诱导过夜时，融合蛋白主要分布在细胞周质中，并且具有生物活性。针对这两种表达模式，分别使用不同的分离纯化工艺。包涵体经变性复性，再采用DEAE-Sepharose弱阴离子交换层析纯化，硫酸铵沉淀浓缩后再通过Sephadex G-75分子筛收集活性组分，得到了纯度为98%的thDNaseⅠ，产量为225mg/L，酶活为592．2U/mg；20℃诱导的细菌在细胞破碎后离心收集上清，硫酸铵沉淀浓缩后采用DEAE-Sepharose弱阴离子交换层析纯化，再经硫酸铵沉淀浓缩，最后通过Sephadex G-75分子筛收集活性组分，得到了纯度为98．2%的thDNaseⅠ，产量为20．5mg/L，酶活为1280U/mg。
⑷将纯化的thDNaseⅠ进行LC-ESI-MS/MS鉴定，获得了trpsin酶解的5个肽段，得分680．23，由此可以判断此蛋白是rhDNaseⅠ。
水解酶;融合蛋白;大肠杆菌;基因表达
北京化工大学
硕士
制药工程
陈劲春
2009
中文
Q556;Q786
66
2010-01-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）