玫瑰微球菌麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在毕赤酵母中的表达研究
海藻糖因其独特的生物学功能近年来被广泛地应用于细胞、组织器官、食品、化妆品和药物制剂、保藏等领域。由麦芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyl trehalose synthase，MTSase）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyl trehalose trehalohy-drolase，MTHase）组成的双酶体系可以将淀粉转化成海藻糖，可望成为工业生产海藻糖的新途径。
本文主要构建了来源于玫瑰微球菌的MTHase蛋白的pPICZAα重组表达载体，在巴斯德毕赤酵母表达体系中进行了分泌表达研究。
首先根据TreZ基因序列设计引物，以玫瑰微球菌基因组为模板，扩增得到1．9Kb目的基因片段。与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子进行菌落PCR及测序验证，序列测定结果与报道完全一致。
目的片段经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切处理后定向插入pPICZαA质粒中，成功构建了MTHase的分泌表达载体pPICZαA-MTH。重组质粒经线性化分别电转化导入Pichia pastoris GS115及KM71菌株中，通过Zeocin浓度梯度筛选高拷贝重组菌株，最终在1000μg/ml的浓度下得到若干个单菌落。对得到的GS115菌株进行表型验证，证明均为Mut+。
通过测定重组GS115（pPICZαA-MTH）及KM71（pPICZαA-MTH）菌株在BMGY培养基中生长曲线，以及BMMY诱导培养基中总蛋白含量随时间的变化曲线，确定的最佳转接时间分别为20h和25h，甲醇诱导时间为72h。
SDS-PAGE结果显示，经0．5%甲醇28℃下诱导72h后，KM71（pPICZαA-MTH）菌株发酵液样品约72．5KD处出现明显条带，而GS115（PICZAα-MTH）菌株没有预期条带。KM71（pPICZαA-MTH）菌株样品western blot出现单一条带，GS115（pPICZαA-MTH）未出现条带，进一步证明MTHase蛋白在KM71菌株中成功表达，而在GS115菌株中未表达。
对GS115（pPICZαA-MTH）菌株不表达原因进行分析。通过RT-PCR证明目的基因在GS115中成功转录，应该是翻译水上的原因导致基因沉默。
海藻糖;毕赤酵母;分泌表达;水解酶基因;麦芽寡糖基;玫瑰微球菌;基因沉默
北京化工大学
硕士
制药工程
袁其朋
2009
中文
Q943.2
63
2010-01-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）