富硒酵母对铜过量导致小鼠肝损伤保护作用的实验研究
铜作为机体一种重要的必需的微量元素，能维护骨骼、血管和皮肤正常的功能，促进骨骼、血管和皮肤胶原生成，参与机体的各种代谢。由它组成的酶类与多种疾病的发生、发展直接相关，其中包括糖尿病、冠心病、动脉粥样硬化、高血脂等。目前研究微量元素多数重视的是锌、铁、硒等，而铜经常是被忽略的。因此，了解人体铜的营养状况，以及进一步了解铜在机体健康和疾病中的作用显得非常必要。
鉴于目前对于铜缺乏研究较多，但铜过量造成的危害以及如何防治等的实验报道研究很少。而且急性铜中毒或者铜过量的病例也很常见，如临床上的Wilson病（肝豆状核变性）是由于基因突变引起过量的铜沉积在肝内，最终导致肝功能受损的一系列的过程。
微量元素硒在人和动物体内的吸收、代谢、运转、分布等规律受肝脏制约，硒是GSH-Px的必需组成部分，GSH-Px能催化还原型谷胱苷肽变成氧化型谷胱苷肽，同时使有毒的过氧化物（ROOH）还原成无害的羟基化合物，并使H2O2分解，因而可以保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的损害和干扰。因此，本文需要探导的是硒能否拮抗过量铜造成机体的损害。
目的:
过量的铜对肝脏具有损伤作用，而微量元素硒作为一种有毒金属的拮抗剂，对于铜具有拮抗作用。以往有人用亚硒酸钠进行实验，但这种无机硒的毒副作用大。本实验选用富硒酵母作为拮抗剂来代替亚硒酸钠进行实验研究，是因为酵母是人类利用最广的微生物，其蛋白质含量高达50%以上，还含有丰富的B族维生素和多种矿物质，被称为优质营养之源，并且具有高度的富硒能力及将化学硒转化为生物硒的能力，大大消除了亚硒酸钠作为一种化学硒对生物体所产生的毒副反应和胃肠刺激。以往研究表明，它能够更高效、更安全地被生物体吸收利用。因此，富硒酵母可以适当的作为一种保健品添加到我们的日常食物当中，以此对患有此类疾病人群的肝脏起到一定的保护作用。
基于上述观点，本实验通过建立小鼠铜过量的实验模型和富硒酵母拮抗铜过量的实验研究，以观察富硒酵母拮抗过量铜引起的肝损伤的效果及其保护作用的可能机制。
方法:
试验一：（铜过量的实验模型）实验动物为昆明小鼠，采用喂以普通全价颗粒饲料辅以定期定量灌胃不同剂量铜溶液，快速建立铜过量动物模型并观察动物体内铜水平的高低、肝脏的病理损伤及其体内的脂质过氧化水平。具体造模方法如下：32只昆明小鼠平均分为4组，第1组为对照组，每天用灌胃生理盐水2次，第2、3、4组作为实验组，分别用不同浓度（12.8、25.6和38.4 mg/ml）的硫酸铜每日灌胃2次，16周后，观察肝组织中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，测定血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）以及血清和肝组织中铜含量，并做肝脏病理以及电镜检查。统计学分析实验结果以平均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS11.5软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），多重比较采用LSD法，肝脏中铜和MDA含量数据经检验方差不齐，以Welch法进行近似方差分析，多重比较采用Tamhane's T2法，P<0.05认为差异具有统计学意义。
试验二：（硒拮抗过量铜效果实验）40只昆明小鼠雌雄各半，平均体重18～22 g。所有小鼠随机分成5组，每组8只，A组：每天用生理盐水灌胃（0.2 ml/次）两次作为正常对照组；B、C、D、E组每天均用512 mg/kg bw·d硫酸铜（以铜计）灌胃，共20 w，作为实验处理组；第16 w时，以灌胃方式分别给予B、C、D组小鼠不同剂量的富硒酵母，即B组：富硒酵母高剂量（60 mg/kg bw·d），C组：富硒酵母中剂量组（40 mg/kg bw·d），D组：富硒酵母低剂量组（20 mg/kgbw·d）；E组小鼠用羧甲基纤维素（为配制富硒酵母的溶剂）灌胃，作为处理对照组。小鼠雌雄分养于塑料不锈钢笼内，室内温度（23±3）℃，自由进食，饮去离子水。第20 w末，所有动物麻醉后处死。
观察补硒对肝脏丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性以及血清和肝组织中铜含量的影响，并进行肝脏病理组织学检查和肝细胞凋亡检测，同时测定血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活性。实验结果以平均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS11.5软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），多重比较采用LSD法，肝脏中铜含量数据经检验方差不齐，以Welch法进行近似方差分析，多重比较采用Tamhane's T2法，P<0.05认为差异具有统计学意义。
结果：
试验一：
第一部分：小鼠铜过量模型的建立。
1.铜过量小鼠的一般状况：
肤色：与对照组比较，铜过量模型组小鼠在实验第3周开始出现皮毛粗糙、稀疏，毛色失去光泽，耳、脚爪、尾巴均出现明显的色泽苍白，牙齿呈黄褐色，并随着实验的时间延长上述症状更加明显。
行为改变：随着实验的进行，铜过量模型组小鼠生长缓慢，身体消瘦。表现出倦怠，活动减少，反应迟钝，怕冷嗜睡蜷缩成团，易受惊吓，饮食明显减少。
2.各脏器铜含量及血清铜浓度的比较：
铜过量模型组小鼠的各脏器铜含量和血清铜浓度与对照组比较均有明显升高（P<0.01），且都随灌胃时间的延长而升高，但心脏中的铜含量在低剂量组和中剂量组之间比较差异无显著性，（P>0.05）。各主要脏器中肝脏内铜的沉积量最大，心脏最少，沉积情况依次排列如下：肝脏>脾脏>肾脏>肺脏>心脏。
3.血清SOD活性和MDA含量的比较：
铜过量模型组小鼠血清中SOD的活性与对照组比较明显降低（P<0.01），并随着灌胃时间的延长有逐渐降低的趋势。铜过量模型组小鼠血清中MDA含量与对照组比较均明显升高（P<0.01）。
4.各组小鼠肝脏病理组织学与酶的检查：
小鼠肝脏病理学检查表明过多的铜沉积可以损伤细胞，使细胞排列紊乱、边界不清，发生水样变性、坏死等病理改变，且在汇管区程度较重，正常组小鼠的肝脏肉眼可见光滑细润，色红，边缘锐利，光镜下HE染色可见细胞排列整齐，细胞形态规则，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶轮廓清晰，肝索排列整齐。模型组特别是高剂量组小鼠的肝脏可见色暗红且增大，质地较脆，光镜下肝细胞排列紊乱，细胞肿胀，空泡样变性，并出现轻度淤血，细胞点状坏死，并可见炎症细胞浸润，在肝小叶间可见点状铜颗粒沉积。
与正常对照组相比，实验组肝组织中MDA含量明显升高（P<0.05），而SOD和GSH-Px活性明显下降（P<0.05）；血清ALT、AST活性以及血清、肝脏铜含量明显升高（P<0.05）；病理组织学检查可见高剂量铜灌胃组小鼠肝细胞变性坏死以及少量铜颗粒沉积；电镜提示肝细胞核、线粒体等细胞器异常，并可见铜颗粒。
试验二：
第二部分：富硒酵母对铜过量导致小鼠肝损伤保护作用的实验研究。
1.不同浓度富硒酵母对小鼠铜过量导致肝脏损伤ALT、AST活性变化情况：
与正常对照组相比，处理对照组和补硒组（低、中、高剂量组）小鼠血清ALT、AST含量显著升高（P<0.05），而低、中剂量组小鼠血清ALT、AST含量显著低于处理对照组（P<0.05）。低、高剂量补硒组小鼠血清Cu含量显著高于正常对照组（P<0.05），但显著低于处理对照组（P<0.05）；而中剂量补硒组小鼠血清Cu含量与正常对照组无显著差异（P>0.05），但显著低于处理对照组（P<0.05）。低、中、高剂量补硒组小鼠肝脏Cu含量均显著高于正常处理组（P<0.05），而低于对照处理组（P<0.05），但中剂量补硒组肝铜含量显著低于高、低补硒组。
2. 肝细胞凋亡和肝匀浆SOD、MDA、GSH-Px活性。
正常对照组小鼠肝脏可见少量凋亡细胞，而处理对照组有较多凋亡的肝细胞；给予低、中剂量的富硒酵母后肝细胞凋亡有所减少，以中剂量组凋亡率减少最显著（P<0.05）。处理对照组小鼠肝匀浆SOD和GSH-Px活性显著低于正常对照组（P<0.05），低、中补硒后活性升高，以中剂量补硒组效果最显著（P<0.05）（表2）。处理对照组小鼠肝匀浆MDA含量显著高于正常对照组（P<0.05），低、中补硒后MDA含量降低，以中剂量补硒组效果最显著（P<0.05）。
3. 肝脏病理组织学检查。
正常对照组小鼠肝脏肉眼见光滑细润，色红，边缘锐利，光镜下HE染色可见细胞排列整齐，细胞形态规则，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶轮廓清晰，肝索排列整齐，处理对照组和高剂量补硒组小鼠肝脏可见色暗红且增大，质地较脆，光镜下肝细胞排列紊乱，细胞肿胀，空泡样变性，并出现轻度淤血，细胞点状坏死，在空白组肝小叶间还可见点状铜颗粒沉积，低、中剂量补硒组小鼠肝脏肉眼见接近正常，镜下细胞肿胀和空泡样变性有所减轻，铜颗粒少见。
过量硫酸铜能导致小鼠肝脏损伤，与低、高剂量富硒酵母添加组相比，补充中剂量富硒酵母能显著缓解这种损伤，表现为血清和肝组织的铜含量显著降低（P<0.05），肝组织中SOD、GSH-Px活性增强（P<0.05），MDA含量减少（P<0.05），肝细胞凋亡显著减少（P<0.05）。
结论：
适量的富硒酵母能降低铜负荷导致的小鼠肝功能损伤，其机制可能与减轻铜离子介导的脂质过氧化有关。
肝损伤;铜过量模型;病理组织学;脂质过氧化;富硒酵母;拮抗剂
南方医科大学
硕士
营养与食品卫生学
罗海吉
2009
中文
R151.3;R595.205.93
49
2010-01-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）