耐高温α-淀粉酶菌株的筛选、发酵条件优化及酶基因的克隆
耐高温α-淀粉酶是目前最重要的工业酶制剂之一，约占酶制剂市场25％的比例。耐高温α-淀粉酶能在较高温度下能够有效快速的分解淀粉，被广泛应用于纺织退浆、发酵、制糖等高温条件下生产工业。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是国内生产耐高温α-淀粉酶的代表菌株之一。
为了获得纺织工业中所需求的耐高温α-淀粉酶，从枯草堆、农田积肥、下水道等处土样中分离得到一株能向胞外分泌耐高温α-淀粉酶的菌株并对其所产酶的酶学性质进行了研究。通过生理生化及分子生物学鉴定，鉴定该菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），并初步命名为Bacillus subtilis C1。Bacillus subtilis C1在基础培养基中（pH7，温度45℃）培养24 h左右达到生长稳定期，在68 h时酶活达到最高，为185.6 u·mL-1。对该菌株分泌的耐高温α-淀粉酶的性质研究表明，此α-淀粉酶最适作用pH值为6，最适温度为70℃。酶的耐热性能较好，在70℃下处理1h，仍具有81％的酶活，适合纺织品高温退浆的需要。
为了获得较高的酶活和产量，在实验中，利用Minitab软件中Plackett-Burman设计和响应面分析法，对耐高温α-淀粉酶产生菌Bacillus subtilis C1的发酵培养条件进行了优化。在单次单因子法得出的适宜条件基础之上，综合考虑了所有影响酶活的因素，并对培养条件进行了统计分析，得到了Bacillus subtilis C1产耐高温α-淀粉酶的最佳培养条件。结果表明：优化培养基的组成（200 mL）为麸皮2.16 g，棉粕粉1.98 g，酵母粉0.40 g，NaCl1.00 g，CaCl20.40 g，淀粉0.10 g。该营养条件下的酶活为2329 u·mL-1，约是培养基优化前酶活的12.6倍，酶活有了显著的提高。
根据Gene Bank中已知的α-淀粉酶基因保守序列设计出特异性引物，通过PCR方法从Bacillus subtilis C1基因组DNA中扩增出了预期的1.5 kb左右的特异性产物。该片段与已报道的解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶编码基因分别有100％和99％的同源性。最大阅读框为1545 bp，信号肽序列93 bp。重新设计引物，获得去除信号肽的α-淀粉酶编码基因，并将其与pPICZαA载体连接后，电击转化Top10 F’菌株的感受态细胞，经质粒抽提、酶切鉴定，确认该目的产物已得到成功克隆。该基因的克隆，为构建α-淀粉酶的工程菌奠定了基础。
α-淀粉酶;枯草芽孢杆菌;发酵条件;酶基因;基因克隆
中南大学
硕士
微生物学
周洪波
2009
中文
TQ925.1;Q556.2
66
2009-12-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）