芳香聚酮抗生素美达霉素生物合成基因的功能研究
聚酮抗生素美达霉素（medermycin）具有抗菌和抗肿瘤等生物学活性，其生物合成途径还未阐明。本文利用生物信息学、遗传学和分析化学等手段，就其生物合成基因簇中几个相关基因展开功能分析，内容包括以下几个方面：
（1）新型C-糖基转移酶基因：根据同源性分析，推断基因med-ORF8可能负责催化美达霉素的C-C糖苷健的形成（Ichinose K.et al.，2003）。本研究首先使用目前较为常用的PCR介导的链霉菌基因突变系统（RedirectTM）对med-ORF8进行基因突变分析：完整的美达霉素生物合成基因簇导入一个特殊大肠杆菌细胞，在这个细胞内，定点敲除美达霉素生物合成基因簇中的这个目的基因med-ORF8，获得-个携带有美达霉素突变基因簇的质粒（命名为pHSL3），将其导入一个常用链霉菌异源表达细胞（Streptomyces coelicolorCH999）中，并进行发酵产物的提取和LC-MS分析。研究发现同野生完整的美达霉素基因簇相比，突变基因簇不能合成美达霉素（初步推断有脱糖基中间产物积累）；然后进行目的基因的互补分析，即构建了一个关于med-ORF8的链霉菌表达质粒pHSL5，导入上面所获得的突变基因簇表达体系中。对基因回补菌株的发酵产物进行分析，发现med-ORF8的导入导致美达霉素又重新产生，说明在美达霉素生物合成途径中，基因med-ORF8确实是个必需基因。
（2）糖基合成酶基因：在美达霉素生物合成基因簇中含有6个脱氧六碳糖基合成酶的同源基因，推测负责稀有的脱氧六碳糖胺（安哥拉糖胺）的形成，前期工作中这6个可能参与糖基合成的基因和上面研究的med-ORF8已经克隆在一个表达质粒上（pAYT55）。本研究利用这个多基因共表达体系来验证这些基因的功能，即将这个多基因共表达质粒通过原生质体转化导入一个能产生芳香聚酮kalafungin（推测与med-ORF8的糖基受体结构相似）的链霉菌细胞（Streptomyces coelicolor B135）中，然后对这个体系的代谢产物进行LC/MS分析。结果显示以上这7个基因的共表达质粒在B135中可以导致美达霉素的积累，而仅含这6个糖基合成酶基因的共表达质粒导入B135中，则没有检测到美达霉素的产生。此结果说明在美达霉素生物合成途径中，这6个基因与med-ORF8共同完成了糖基合成和糖基转移的功能。
（3）新型转录调控基因：根据同源性分析推断在美达霉素生物合成基因簇中的med-ORF10为一个新型转录调控基因（Taguchi T.et al.，2007）。前期工作中利用RedirecTM系统已经构建好一个突变基因簇（即在完整美达霉素生物合成基因簇中定向敲除目的基因med-ORF10）。本研究将携带这个突变基因簇的质粒pAYT64通过原生质体转化导入链霉菌的异源表达宿主（Streptomyces coelicolor CH999）中。对获得的菌株的发酵产物进行LC-MS分析。结果显示由于这个基因的敲除导致美达霉素产量急剧减少，同时有中间体积累，说明该基因在美达霉素生物合成中起到正向调控作用。
以上这些研究结果为进一步阐明美达霉素的生物合成途径奠定了基础。
美达霉素;生物合成;链霉菌;基因敲除;天然产物;基因功能;芳香聚酮;生物学活性
华中师范大学
硕士
微生物学
李爱英
2009
中文
TQ460.38
92
2009-11-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）