生物法生产新型抗氧化剂2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的研究
本论文建立了高效液相色谱法检测2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的方法。该方法色谱条件为：Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱（5μm，4.6mm×150 mm）；流动相为含0.08％三氟乙酸的水溶液；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测器为DAD检测器，检测波长236 nm；进样量：20μL。
在日本学者研究的基础上有效简化分离纯化步骤，粉碎枸杞干果，浸提后采用FPLC提取到纯度较高的AA-2βG。FPLC条件如下：色谱柱：HiPrepTM16/10 QXL；流动相：5％醋酸；流速u：5.0 mL/min；上样量：10 mL/次；紫外检测波长λ：254nm。
实验比较酶的分离纯化方法，提取枸杞中可能有糖基转移活性的酶，进行转化试验，经检测发现，最终获得的酶中，无一具有糖苷转移活性。
从产纤维素酶菌种中筛选到产糖苷转移酶的菌种，提取粗酶进行转化，LC/MS检测转化液、枸杞提取物和标样，确定转化液中含有和标样相同分子量的物质，枸杞提取物中的主要物质也与标样分子量一致，三者分子量均为338。通过DPPH自由基清除法发现，1 min内抗坏血酸清除自由基效果迅速，之后趋势减缓，此时AA-2βG的清除优势开始显现，而转化液中同步合成的相同分子量的AA-6βG不具有抗氧化性的，AA-2βG清除自由基的总量大于抗坏血酸，证实了报道中1分子AA-2βG清除大于1分子自由基的说法。
在此基础上，对该菌种的发酵产酶条件进行优化，得到以下最佳发酵条件：稻草粉15.0％，麸皮5.0％，（NH4）2SO40.4％，MgSO40.012％，1倍CMC的吐温-40，10 mL自来水，pH自然，放入250 mL锥形瓶中，接种量为1 mL培养48 h的种子培养液，32℃下培养4d。对转化过程中糖基供体浓度、VC浓度、加酶量和转化时间进行优化，初步确立合适的转化条件为：以浓度为40 mg/mL纤维二糖作为葡萄糖基供体，浓度为40 mg/mL的维生素C作为受体，16 mgmL酶浓度，以pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液为溶剂，在温度37℃下反应24 h。
测定自制纤维素粗酶粉和3种商品纤维素酶中三种酶组分FPA酶、CMC酶和C1酶活，具有糖基转移活性的养乐多纤维素酶和自制纤维素酶的C1酶组分明显高于其余两种商品纤维素酶，这两种商品纤维素酶不能转化合成AA-2βG，推断该组分酶活与糖苷的合成有一定关联，后续研究可改良产该组分酶的基因，提高酶活。
AA—2βG;抗坏血酸;纤维素酶;抗氧化剂;枸杞;糖基转移活性酶;发酵转化;生物法生产;菌种筛选
浙江工业大学
硕士
微生物学
裘娟萍
2009
中文
TQ466.3;TQ033
73
2009-11-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）