角质细胞生长因子(KGF)的表达及其生物学活性研究和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂稳定转染筛选模型的建立
本论文分为两章，第一章研究了角质细胞生长因子的表达及其生物学活性，第二章建立了基于报告基因的成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂细胞筛选模型。
角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)是Rubin等(1989)从胚胎肺成纤维细胞培养上清中发现的，这种细胞因子的靶细胞为上皮细胞，分泌细胞为各种来源的间质细胞，其作用是促进上皮细胞的生长、分化、迁移。在治疗皮肤创伤、角膜损伤、消化性溃疡及放化疗损伤防护等方面具有诱人的应用前景。本章在前人工作的基础上，主要研究了工程菌的诱导表达条件，产物发酵及纯化，产物的生物学活性，以及烫伤药制备和药效研究。
对工程菌表达融合蛋白GST-KGF的条件进行研究，结果表明GST-KGF可溶表达的最佳条件为诱导温度22℃，诱导物IPTG浓度0.5mmol/L，诱导时菌体密度OD600约为0.96，诱导时间5h。在该诱导表达条件下，摇瓶发酵实验每升发酵液GST-KGF的产量为28.39mg，占菌体总蛋白的8.66％。罐上发酵体系中的GST-KGF产量为277.8mg/L，占菌体总蛋白的29％。
采用GSH-sepharose凝胶对GST-KGF蛋白进行亲和吸附，并用凝血酶切除融合蛋白N端的GST部分，最后得到电泳纯的KGF，分子量为17KD左右。在罐上发酵体系中，1L发酵液可得83.0mgKGF蛋白，总纯化率为50％。并且利用ELISA实验检测了所得KGF的免疫学活性。
在上述工作的前提下，我们对KGF的生物学活性进行了研究，对小鼠背部进行深II度烫伤，检测KGF对伤口的修复能力，最终我们确定使用浓度为10μg/创面的KGF可以很好地促进伤口的愈合。在此前提下，进一步研制了三种不同基质的KGF烫伤药，并且检测三种配方烫伤药对小鼠伤口愈合的促进作用，发现配方一的烫伤药乳膏有明显的促进伤口愈合的能力，其药效甚至比市面上的某些烫伤药还好。其愈合率与愈合同期的阳性药物相比，普遍提高了30％-50％。结果证明，所研制的配方一烫伤乳膏有良好的治疗功效，具有较好的应用前景。
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factors，bFGF)是1970年代第一次从牛的脑组织中分离出来的。同其它成纤维细胞生长因子一样，它具有有丝分裂原性。成纤维细胞生长因子具有多重的生物学活性，包括细胞的增殖、分化和迁移。它们也可以激发原癌基因诱发肿瘤的形成和发展。本文的研究内容包括FGFR(fibroblast growth factors receptor， FGFR)抑制剂稳定筛选模型的建立，利用此稳定筛选模型筛选微生物发酵粗提物，并且利用western-blot检测具有活性的粗提物对bFGF信号传导通路的影响。
利用稳定转染的方法共转染pCDNA3.1(-)和pGL3-SFiRE双质粒于NIH3T3细胞，通过G418抗性和荧光素酶反应两步筛选，建立稳定的筛选模型，并得到了F10-9，A7-12，E1-9这三株pGL3-SFiRE-NH3T3稳定细胞株。通过这个筛选模型的筛选，最终得到了191、LX、hZL02a-1、HQGa-9、Ty02b-5这5种具有抑制活性的粗提物。利用western-blot检测这些具有活性的粗提物对FGF信号传导通路中关键酶的影响以及对FGFR的抑制情况。最终发现Ty02b-5和180这两种粗提物抑制了FGFR的磷酸化，并且在对p-PLCγ的检测中发现经过这两种粗提物处理后p-PLCγ的量明显减少。说明两种粗提物中的某种成分可能是我们所寻找的bFGFR的抑制剂，并且通过PLCγ途径对bFGF的信号传导产生影响。
本部分的工作是阶段性的，至于这两种粗提物中的哪种成分对FGFR存在抑制，还需要通过活性追踪实验进一步确定，他们在FGFR上的具体作用位点及作用机制也有待进一步研究。
角质细胞生长因子;生物学活性;成纤维细胞生长因子受体;稳定转染;筛选模型
厦门大学
硕士
微生物学
郑忠辉
2009
中文
Q813
92
2009-11-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）