应用质谱技术筛选激酶抑制剂
蛋白激酶是一类磷酸转移酶，可将ATP的γ磷酸基转移到底物特定的氨基酸残基上，使蛋白质磷酸化。蛋白激酶在调节细胞的多种生命活动和疾病的进程中发挥着关键作用。异常的磷酸化与许多疾病相关，如癌症、炎症或免疫系统紊乱等。以蛋白激酶作为药物靶点，寻找与之相互作用的小分子化合物，并进一步优化用于新药研发是当今蛋白激酶研究领域的一个重要方向。传统的激酶抑制剂筛选方法虽然可以采用高通量的方式进行，但仍然存在以下缺点：偶联反应易导致非特异性结果、放射性同位素或荧光标记底物价格昂贵并可能产生同位素污染、筛选操作过程复杂易出现假阴性或假阳性结果等。因此，结合高通量的特点，寻求补充的激酶抑制剂的筛选方法非常有意义。
随着质谱技术的不断改进和完善，质谱的应用范围已扩展到生命科学研究的许多领域。质谱用于酶活性的测定及酶动力学研究也越来越广泛。本文应用质谱技术建立了激酶抑制剂的筛选方法，具体如下：
(一)以新功能蛋白激酶RX218为研究对象，建立了激酶抑制剂高通量筛选方法。采用经典的Fmoc固相合成策略，以及平行合成及“混—分”编码合成等组合化学技术合成了含有86条多肽的肽库，并结合Kinase—Glo()发光检测法筛选到了RX218激酶底物(Pep8)。以Pep8为底物，经过优化激酶反应体系中的ATP浓度、激酶用量、底物Pep8浓度等首次建立了激酶RX218的Kinase—Glo()发光检测筛选模型。应用该模型对本课题组的640个单一纯化合物进行筛选后，发现8个活性化合物。其中活性较高的2个化合物的IC50值分别为38.7μM(P3—A7)和43.2μM(V8807)。
(二)以Pep8为激酶RX218的多肽底物，采用HPLC—MS联用技术中的质谱阀切换功能进行样品脱盐前处理，通过优化液相梯度、质谱检测条件以及激酶反应体系等，建立了激酶抑制剂的色谱—质谱联机筛选方法。研究中对LC—MS筛选体系进行了系统的方法学考察，并对筛选模型的稳定性进行了评价。结果表明，该方法线性、重复性良好。Z'因子评价表明该方法可用于高通量筛选。
(三)应用已建立的模型对20个联苯类化合物进行了初步构效关系研究，并发现化合物V8804活性高于V8807。利用UHP氧化法合成了内标物Pep8(O2)-P，在存在内标及无内标的条件下，应用质谱法测定其IC50值分别为19.1μM及14.4
μM。同时应用Kinase—Glo()发光检测法测得其IC50值为15.4μM，证明两种方法检测结果一致。
(四)应用已建立的模型，筛选了本课题组现有的1，2，7.三取代—1H—咪唑并[4，5—g]喹喔啉—6—酮类混合物化学库(1850个化合物)。发现了4个对RX218有抑制作用的化合物，其IC50值分别为38.3μM(F3—E)，98μM(E5—A)，110μM(D6—D)，72μM(D6—E)。全文总共发现了13个活性化合物，其中活性较高的4个化合物为P3—A7，V8807，V8804，F3—E。
综上所述，本论文创新点如下：
1.建立了LC—MS激酶抑制剂筛选新方法。该法特点是：均质显著减少了假性结果、不需要标记底物节约了筛选成本、无同位素标记免除了放射性对实验者以及放射性同位素垃圾对环境的危害、不需要偶联反应可以直接对抑制作用进行定量。
2.将组合化学混合物合成化学与LC—MS高通量筛选相结合进行混合物化学库筛选，显著提高了筛选效率。
3.应用HPLC—MS联用技术及质谱的阀切换功能进行样品的脱盐处理。
4.LC—MS激酶抑制剂筛选新方法与传统Kinase—Glo()发光检测法结果一致。
5.筛选并首次确定了激酶RX218的多肽底物Pep8。
6.发现了4个抑制RX218的较高活性化合物(IC50<50μM)。
蛋白激酶;抑制剂;质谱技术;高通量筛选;化学混合物;多肽底物Pep8
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
药物化学
刘刚;再帕尔
2008
中文
R915
142
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）