抗人DR5单抗AD5-10诱导肺癌细胞凋亡敏感性的作用及其分子机制的研究
AD5—10是一株新的鼠抗人死亡受体5(death receptor 5,DR5)单克隆抗体,为本实验室在前期研究中获得,能够强烈诱导多种肿瘤细胞系发生凋亡,抑制小鼠体内移植瘤的生长,对人正常肝细胞和人外周血淋巴细胞没有明显的诱导毒性,已成为研发生物类药物的候选者,具有抗肿瘤作用的应用前景。但是研究发现,某些肿瘤细胞对AD5—10的诱导却表现为明显的抗性,其抗性是否具有一定的表现规律,其内在的调控机制又是什么,仍然是目前一个有待阐明的科学问题。
本论文拟选用肺癌细胞系A549、SCLC、H460、H1299和Calu—3,分析细胞表面DR5表达水平与细胞对AD5—10诱导凋亡敏感性之间的关系:并进一步寻找凋亡相关调节分子,研究其调节细胞对AD5—10诱导凋亡敏感性的内在分子机制。本研究所选的五株肺癌细胞中,A549和SCLC细胞对AD5—10中度敏感,其他三株细胞对AD5—10不太敏感。研究表明,这五株肺癌细胞对AD5—10的敏感性与细胞中DR5的表达水平无关。但发现,使用AD5—10处理,敏感或中度敏感细胞中,c—FLIPL发生明显的切割,c—FLIPL的表达量显著下降;而不太敏感或抗性的细胞中的c—FLIPL的表达水平没有明显变化。表明c—FLIPL是参与调节AD5—10诱导细胞凋亡的关键分子。
进一步研究证明,c—FLIPL过量表达可以部分抑制人T淋巴细胞白血病细胞SVT35、人肺癌细胞A549对AD5—10的敏感性;而亚毒性浓度的化疗药物环磷酰胺(CHX)、放线菌素D(ActD)能通过下调细胞中c—FLIPL蛋白表达水平,增强AD5—10对肺癌细胞的杀伤活性。此外,通过c—FLIPLsiRNA特异抑制细胞中的c—FLIPL的表达,可以显著增强多种肺癌细胞对AD5—10诱导凋亡的敏感性。其调节机制是c—FLIPLsiRNA和AD5—10能激活细胞中caspase依赖的信号通路,下调Bcl—2家族蛋白Bid和Bcl—XL的表达,进而促进线粒体膜电位的降低以及细胞色素C的释放。并且,研究证明c—FLIPLsiRNA和AD5—10联合作用对正常人细胞没有毒性。
最后,检测了人肺癌组织中c—FLIPL的表达,结果显示c—FLIPL特异高水平表达于人肺癌组织中的肿瘤细胞中,而在正常组织和肿瘤细胞周围间质细胞中表达量很低,两者在统计学上具有显著差异。以上研究提示特异下调c—FLIPL可能是一种非常有潜力的治疗肺癌的策略,特别是针对那些对功能性单抗单独作用产生抗性的肿瘤病人。
第二部分研究中,本文还利用AD5—10可变区基因,构建了表达鼠单链抗体(ScFv)的原核表达载体,并获成功表达。初步证明了它们的肿瘤杀伤活性。同时,将AD5—10的可变区基因和人抗体恒定区基因,分别克隆入表达载体pKN100VL和pG1D105VH,通过筛选获得了稳定表达和分泌人—鼠嵌合抗体(antl—DR5mV—hH)的重组细胞;分泌表达的嵌合抗体与人DR5蛋白具有特异性结合活性,并且能明显杀伤体外培养的人T淋巴细胞白血病Jurkat细胞,为发展人源化抗体药物的研究奠定了基础。
肺癌;细胞凋亡;敏感性;分子机制;单克隆抗体AD5-10;人DR5蛋白
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
生物化学与分子生物学
刘彦信;郑德先
2008
中文
R734.2;R730.21
109
2009-09-28(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)