力达霉素生物合成调控基因sgcR3功能研究及其与sgcR1和sgcR2调控关系的研究
力达霉素(lidamycin)是一种新型的烯二炔类抗肿瘤抗生素，又名C—1027，由球孢链霉菌C—1027(S．globisporusC—1027)产生。经过十余年的新药研究和开发，目前力达霉素已经进入临床Ⅱ期研究。力达霉素生物合成基因簇已被克隆和测序，其基因簇中一些生物合成酶的功能和生物合成步骤已经阐明，但其生物合成的调控机制尚未见报道。
根据生物信息学分析的结果，力达霉素的生物合成基因簇中至少存在三个调控基因sgcR1、sgcR2和sgcR3。sgcR3基因的产物SgcR3蛋白与泰乐菌素生物合成途径特异性正调控蛋白TylR具有较高的同源性。sgcR1基因的产物SgcR1蛋白与S。griseus链霉素生物合成的途径特异性激活因子StrR高度同源。蛋白SgcR2属于AraC/XylS转录因子家族。sgcR2与sgcR1串联，两基因间相隔25个碱基，推测其与sgcR1位于同一个操纵子。sgcR3和sgcR2基因内部各含有一个TTA稀有密码子。在三个已知的九元环类烯二炔基因簇(C—1027，新制癌菌素和maduropeptin)中，sgcR1、sgcR2和sgcR3及它们的同源基因均围绕在烯二炔聚酮合酶基因(PKSE)及其相关基因附近，并且基因排列组成也非常相似，推测sgcR1、sgcR2和sgcR3对这类抗生素生物合成具有重要的调控作用。
本工作采用同源重组双交换的方法将sgcR3基因阻断，研究sgcR3的生物学功能。分别以阿普霉素和硫链丝菌素抗性基因片段作为插入片段构建了sgcR3阻断突变株S．globisporus R3KO1和S．globisporus R3KO，阻断突变株不产生力达霉素。用三种质粒pKCR3、pSETR3和pLR3分别导入在自身启动子控制下和强启动子控制下的sgcR3对阻断突变株S．globisporus R3KO进行互补，均能恢复力达霉素的产生。在野生菌株中过量表达sgcR3可提高力达霉素的产量。以上结果说明SgcR3是力达霉素生物合成的正调控因子。为了确定sgcR3所调控的下游基因，本工作在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化了SgcR3蛋白。凝胶阻滞实验结果表明SgcR3可结合于sgcR1R2基因上游片段。
将带有自身启动子和/或强启动子ermE*p的sgcR1、sgcR2以及sgcR1R2分别克隆至载体pKC1139的多克隆位点，导入野生菌株中进行过表达研究，结果发现均能不同程度的提高力达霉素的产量，提示sgcR1和sgcR2对力达霉素的产生有促进作用。交叉互补实验结果表明，sgcR3的导入不能使sgc R1R2阻断突变株S. globisporus R1R2KO恢复力达霉素的产生，sgcR1、sgcRIR2的导入则可使S。globisporus R3KO恢复力达霉素的产生，表明sgcR3在力达霉素生物合成途径特异性调控网络中位于sgcR1和sgcR2上游。实时定量RT-PCR结果显示，sgcR1和sgcR2的转录水平在S．globisporusR3KO中明显下降，而sgcR3的转录水平在S．globisporus R1R2KO中无明显变化，证明了sgcR3可调控sgcR1和sgcR2表达，这与交叉互补和SgcR3凝胶阻滞的实验结果一致。几个结构基因sgcA1、sgcC4、sgcD6和sgcE8在S．globisporus R3KO和S．globisporus R1R2KO中的表达量也都显著下降。本工作还构建了sgcR1和sgcR2的大肠杆菌表达质粒，并转入大肠杆菌BL21(DE3)进行了表达和纯化。为进一步研究sgcR1和sgcR2的功能奠定了基础。
综上所述，本工作通过对球孢链霉菌C—1027力达霉素生物合成基因簇中sgcR3基因进行阻断、互补和过表达研究，确定了sgcR3的正调控功能。并对sgcR3的分子调控机制进行初步研究，确定了其靶基因为sgcR1R2，在途径特异性级联调控网络中位于sgcR1R2的上游，为阐明力达霉素生物合成调控网络并应用代谢工程手段构建力达霉素高产菌株奠定了基础。
力达霉素;生物合成;调控基因sgcR3;调控基因sgcR1;调控基因sgcR2;正调控功能
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
微生物与生化药学
洪斌;李元
2008
中文
R915
135
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）