依博素生物合成基因ste5、ste22的克隆、表达和功能研究
链霉菌(Streptomyces)是工业重要微生物之一，能产生大量的次级代谢物，主要有抗生素等，然而有关链霉菌胞外多糖的研究除本实验室外国内外尚未见报道。本研究室自行构建了以基因重组白细胞介素—1(interleukin—1，IL-1)可溶性受体为靶位的受体拮抗剂筛选模型，获得了一种由链霉菌139产生的新型胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)依博素，经药效学研究证明依博素对类风湿性关节炎有明显疗效，并且毒性较低，已申报临床研究，有可能发展成为临床治疗类风湿性关节炎的新药。
本室已确定了由27个开放阅读框架(ORF)构成的依博素生物合成基因簇(ste)。为了阐明依博素生物合成途径，研究依博素结构与生物活性关系并获得新型依博素衍生物，已对不同基因功能进行了深入研究，本文的研究对象为ste5和ste22基因。
根据基因同源性分析，ste5基因编码的蛋白可能是引导糖基转移酶，在依博素生物合成中启动第一步反应。为了解ste5在依博素生物合成中的功能，通过同源重组双交换对ste5进行了基因阻断研究，获得了基因缺失突变株Streptomycessp.139(ste5—)，其产生的多糖EPS—5m单糖组分中半乳糖含量明显下降，全部丧失对IL-1R的拮抗活性，同时EPS—5m的分子量较依博素明显降低。
为了确定ste5编码产物性质，在大肠杆菌成功进行了基因克隆表达，并纯化了重组蛋白，其分子量为54KD。酶学活性研究证明Ste5为半乳糖糖基转移酶，能够催化1—磷酸半乳糖由UDP—半乳糖转移到Streptomycessp.139细胞膜脂质载体上，形成磷酸糖脂，从而作为引导糖基转移酶启动了依博素的生物合成，因此ste5是依博素的关键的生物合成基因。
为了证实ste22基因编码产物性质，以pBV220为载体，在大肠杆菌成功进行了基因克隆表达，并纯化了重组蛋白Ste22，其分子量为35KD。酶学活性研究证明Ste22为鼠李糖糖基转移酶，能够催化鼠李糖基由TDP—L—rhamnose转移到多糖重复单元增长链，形成糖苷键，在依博素生物合成中具有重要作用。
本文有效确定了ste5和ste22基因在依搏素生物合成中的作用，为通过组合生物学途径研究多糖结构与生物活性关系，获得具有生物活性的新结构多糖奠定了较好的基础。上述研究均未见国内外报道。
依博素;生物合成;ste5基因;ste22基因;基因克隆;基因表达
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
微生物与生化药学
李元
2008
中文
R915
117
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）