肝脏富集转录因子在体外肝细胞分化过程中的作用研究
研究背景和目的：
肝脏是体内进行物质代谢的重要器官，其中肝细胞约占肝脏组织的80％。肝细胞特异表达一系列编码血浆蛋白、凝血因子和多种肝脏解毒作用及维持糖类物质、脂肪和胆固醇代谢相关酶的功能基因。肝细胞特异表达基因的功能分析研究发现这些基因的调节区由结合不同家族的肝细胞转录因子的顺式作用元件组成。不同家族的肝脏富集转录因子形成蛋白复合物协同调控肝细胞特异基因表达的启动和维持。
肝细胞核因子4α(HNF4α)在很多肝细胞功能基因的启动子或增强子上有结合活性，可以直接调控多达40％左右的肝细胞特异基因的表达。此外，HNF4α还可以通过调控多种其它家族肝细胞分化相关转录因子的表达间接调节肝细胞功能。因此，转录因子HNF4α很可能位于肝细胞相关转录因子调控网络的上游并对于肝细胞功能基因的表达起核心调控作用。目前，对于HNF4α的功能研究集中在胚胎肝脏发育和成熟肝细胞功能维持方面，但是对于肝细胞分化过程尤其是体外诱导分化过程中HNF4α的表达和尚未见报道。
骨髓干细胞(bone marrow stem cells，BMSCs)可以分化为肝前体细胞和肝细胞，并具有取材容易，增殖能力强，体外培养、传代及扩增容易的特点，可以作为研究体外诱导分化肝细胞的可靠来源。但是骨髓干细胞诱导向成熟肝细胞分化的具体诱导机制目前尚不清楚。因此，本研究在骨髓间充质干细胞体外向肝细胞诱导分化过程中的培养细胞进行肝细胞标志基因及转录因子mRNA表达水平检测。在此基础上应用RNA干扰技术抑制转录因子HNF4α的转录水平，并深入研究大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞体外诱导分化过程中转录因子HNF4α调控的作用机制，深入了解细胞分化机制，并为临床促进肝细胞分化增殖提供理论基础。
实验方法：
1、提取大鼠骨髓细胞诱导其向肝细胞分化。通过形态学表现，ALB免疫荧光染色定位，半定量逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肝细胞特征性标志ALB、AFP的mRNA的表达，生化方法检测白蛋白、尿素和ALT的在细胞培养液中的浓度以及PAS染色方法检测细胞糖原合成能力来验证大鼠骨髓间充质干细胞经过体外诱导分化培养后是否具有成熟肝细胞的功能。
2、应用半定量RT-PCR方法比较肝细胞分化过程中肝脏富集转录因子肝细胞核因子4α(HNF4α)，CCAAT增强子结合蛋白α和β(C/EBPα和C/EBPβ)在诱导分化组和对照组细胞中的mRNA表达水平和免疫荧光染色方法在荧光显微镜下观察HNF4α细胞中的表达定位，获得骨髓间充质肝细胞向肝细胞体外诱导分化过程中上述三种转录因子的表达特征。
3、分别在大鼠骨髓干细胞的诱导分化过程中的三个时间点应用RNA干扰技术抑制转录因子HNF4α的mRNA表达。应用Realtime RT-PCR及HNF4α免疫荧光染色方法检测HNF4α mRNA和蛋白水平的表达，检验RNA干扰的抑制效果。同时，应用Realtime RT-PCR，细胞培养液生化检测，ALB免疫荧光染色和PAS染色方法检测HNF4α表达抑制对于诱导分化细胞的肝细胞特异基因ALB、AFP和HNF1α的mRNA表达水平，白蛋白表达水平和分泌能力，合成尿素和储存糖原能力的影响。
研究结果：
1、大鼠骨髓间充质干细胞经诱导分化培养后细胞具有成熟肝细胞的形态。在大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化培养的7天、14天、18天和21天四个时间点，成熟肝细胞标志ALB和AFP mRNA的表达水平明显高于非诱导培养对照组细胞(p<0.05)。应用ALB的特异性抗体进行的免疫荧光染色显示，骨髓间充质干细胞在分化14天后，细胞质中充满了大量点状，或颗粒状的绿色的荧光染色。此外，诱导分化细胞产生白蛋白、尿素和ALT以及合成及储存糖原的功能要明显强于对照组细胞。
2、在骨髓间充质干细胞体外诱导分化培养细胞中，转录因子HNF4α、C/EBPα和C/EBPβ mRNA均有表达，其中诱导分化组HNF4α和C/EBPα在细胞分化早期、C/EBPβ在分化晚期表达分别显著高于对照组(p<0.05)。在HNF4α mRNA表达水平显著高于对照组的诱导分化14天时间点，免疫荧光染色显示诱导分化组细胞有HNF4α特异染色定位于分化细胞核内，而对照组细胞中并未观察到细胞核内有特异染色。
3、在骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化的7天、14天和21天三个时间点，
对诱导分化细胞瞬时转染HNF4α的siRNA后，HNF4α的mRNA表达水平相比于正常诱导分化细胞降低了40％，而HNF4α免疫荧光染色显示转染siRNA的细胞核内HNF4α的特异染色明显减少，说明转染HNF4α siRNA有效抑制了诱导分化细胞中HNF4α mRNA和蛋白水平的表达。在HNF4α表达下调的细胞中，成熟肝细胞标志AFP和HNF1α的mRNA表达水平、尿素产生及糖原合成储存能力显著低于同时间点正常诱导分化细胞。另一个肝细胞标志ALB mRNA和蛋白水平的表达则仅在诱导分化早期受HNF4α的调控。而在诱导分化进行至21天时，ALB的mRNA和蛋白水平的表达水平都与HNF4α表达下调无关。
研究结论：
1、大鼠骨髓间充质肝细胞在生长因子HGF，EGF，bFGF，地塞米松和胰岛素的诱导培养下可以分化为具有成熟肝细胞功能和形态的肝细胞样细胞，可以作为体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的可靠模型。
2、肝细胞分化过程中转录因子HNF4α、C/EBPα和C/EBPβ呈特征性时序表达，表明骨髓间充质干细胞在向肝细胞分化时，肝细胞相关转录因子的表达与细胞分化的启动和维持密切相关。
3、HNF4α对骨髓间充质干细胞来源的肝细胞的特异标志和大部分生理功能有直接和间接的调控作用，是体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成熟肝细胞分化过程中的关键转录因子
肝脏富集转录因子;肝细胞分化;肝细胞核因子;骨髓间充质干细胞;体外诱导分化
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
硕士
外科学
曲强
2008
中文
R329.2
87
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）