高效表达重组HIV-1膜蛋白gp41及其在尿液检测中的应用
人获得性免疫缺陷综合症(AcquiredImmunodeficiencySyndrome，AIDS)，简称艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)引起的。自1983年中国出现首例HIV感染者至2007年10月底，中国累计报告艾滋病病毒感染者223501例，其中艾滋病病人62838例，死亡报告22205人。尽管经过20多年的研究，在HIV基础研究和预防治疗方面取得了较大进展，但是现在仍然没有彻底治愈AIDS的手段和令人满意的疫苗。目前控制HIV流行的主要方法是仍然是行为干预。因此，及早发现HIV感染病例对控制HIV流行起着举足轻重的作用。
HIV感染人体后，患者体内可产生针对HIV结构蛋白的特异性抗体，包括核心蛋白(P24、P17)；膜蛋白(HIV—1：Gp160、Gp120、Gp41；HIV—2：Gp140、Gp105、Gp36)以及病毒酶蛋白(P66、P31)的抗体[3，4]。其中外膜蛋白的抗体在病人一经产生就一直维持较高水平，因此，检测HIV—1膜蛋白的抗体，特别是gp41的抗体是判断是否感染HIV的标准之一。
常规HIV检测通常是以血液为检测对象，近年来以尿液、口腔渗出液为样本的HIV检测试剂逐渐受到关注。与血液检测试剂相比，这些检测试剂具有无创、无传染性等优点，在快速检测、研究同性恋等特定人群的HIV感染情况等领域得到了一定程度的应用。与血液检测试剂相比，因为尿液中的HIV特异性抗体浓度低，尿液HIV检测试剂对使用的抗原的质量要求更高。
本文以研制高质量HIV—1gp41诊断用抗原，制备HIV—1尿液检测试剂为目的，包括如下几个方面的内容：
1、重组gp41的基因优化及原核表达质粒的构建：在本室保存的HIV—1gp41表达质粒pGEX—5X—1—rgp41的基础上，用长引物多聚酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)法对gp41基因上游80bp进行大肠杆菌偏爱密码子优化，经过2轮PCR反应完成了基因优化并在基因上下游引入了酶切位点；然后将优化后的基因分别插入到原核表达载体pTXB、pET32a、pET22b中，构建原核表达质粒。
2、重组gp41的表达和纯化：分别将上述构建的原核表达质粒进行表达筛选；最终选用pET22b—mgp41进行大量表达和纯化，使用破菌、洗涤包涵体、金属螫合层析和分子筛层析等步骤纯化重组Gp41，最终得到的重组Gp41纯度大于95％。
3、重组Gp41大量发酵的工艺摸索：使用小型发酵罐对重组表达菌的大量发酵工艺进行了摸索，通过优化细菌生长条件，2.5L的培养物经过8小时的培养和诱导表达最终可以得到120g湿菌，目标蛋白的表达量达到25％以上。
4、尿液HIV—1抗体检测方法的初步建立和样品考核：使用本研究中制备的重组Gp41抗原，制备尿液HIV—1抗体检测试剂盒，并用临床样本对试剂盒进行了样品考核。考核结果显示，本研究建立的HIV—1抗体尿液检测方法的灵敏度和特异性分别达到了100％和98.52％，可以满足HIV—1初筛实验的要求。
人获得性免疫缺陷综合症;艾滋病;HIV-1膜蛋白;表达重组;gp41抗原;尿液检测
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
硕士
免疫学
曾毅;周玲
2008
中文
R512.91;R446.12
75
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）