EGFR抑制剂及联合放化疗对头颈鳞癌体外治疗和疗效预测
目的：
头颈癌被认为是第七大常见肿瘤，其中鳞状细胞癌(Squamous cell carcinoma of the head and neck，HNSCC)占头颈癌的90％。手术、放疗或手术联合放疗是头颈癌治疗的基础。近年来，随着放化疗联合治疗模式的逐步建立，晚期病人生存率和局部控制率有了一定程度的提高。然而在头颈癌放化疗治疗中仍然存在一些问题，如：放化疗毒副作用大、肿瘤对放化疗不敏感、治疗后病人复发率高、5年生存率低等。迄今为止，头颈癌放化治疗和疗效预测仍是肿瘤治疗的一个难题。
肿瘤特异性分子的靶向治疗具有特异性强、在有效杀灭肿瘤细胞的同时不损伤正常组织的优点，它是针对可能导致细胞癌变的环节，从分子水平逆转这种恶性生物学行为，从而抑制肿瘤细胞生长的生物治疗模式。其中表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)是当前分子靶向治疗研究的热点。EGFR是ErbB酪氨酸激酶受体。该家族共有4个成员即EGFR/ErbB1，HER2/ErbB2，HER3/ErbB3及HER4/ErbB4。ErbB与特异的配体结合形成配体—受体二聚体，随后发生自身磷酸化，激活其下游主要信号通路，调节细胞功能，如细胞增殖、凋亡、血管形成、细胞粘附等，可导致细胞癌变，进而发生浸润及转移等。研究表明，80％—90％头颈鳞癌患者的EGFR为阳性。EGFR的过度表达与预后差、转移快、生存期短和放化疗不敏感等密切相关。
EGFR的靶向药物主要有两类：一类为单克隆抗体，如西妥昔单抗(Cetuximab，Erbitux，IMC—C225)，它是特异性阻断EGFR的IgG1单克隆抗体，针对受体胞外配体连接区，阻止配体与受体的结合而抑制受体的激活。另一类为小分子酪氨酸激酶抑制剂，如易瑞沙(Gefitinib，Iressa，ZD1839)，主要抑制受体胞内酪氨酸激酶活性区。
EGFR靶向药物只起到抑制肿瘤的作用，不能杀伤肿瘤细胞，其有效率在10％左右。因此，靶向治疗联合放化疗可能有利于提高疗效，减少副作用，是肿瘤治疗的发展趋势。
目前，在晚期头颈鳞癌治疗中，有学者报道Cetuximab联合放疗或化疗提高了疗效。但Gefitinib联合放疗是否也有相似的疗效；Cetuximab联合化疗(Cisplatin)及常规放疗是否能提高疗效；以及对它们疗效的预测，国内外未见报道。本实验利用10株头颈鳞癌细胞克隆模型，分别比较单药治疗、联合治疗对细胞生存活性的影响，同时检测了10株HNSCC细胞的ErbB家族成员蛋白表达及信号通路关键因子，预测EGFR抑制剂在头颈鳞癌治疗中的疗效，为进一步提高头颈鳞癌治疗疗效，合理应用靶向治疗提供重要线索。
方法：
一、研究对象
新建的10株人头颈鳞癌细胞系，标记为UT—SCC(本文简写为SCC)。SCC—8，SCC—9，SCC—11，SCC—19a，SCC—29，SCC—34和SCC—38来源于喉癌(其中SCC—9源于颈转移，SCC—11源于复发病例)，SCC—24a1，SCC—24a2和SCC—40来源于舌癌。
二、研究方法
1、细胞培养：
细胞系传代于15—30代之间。10％热灭活胎牛血清(fetal bovine serum，FBS) DMEM培养基贴壁生长，孵育箱培养，0.01％胰蛋白酶(trypsin)及0.02％K—EDTA消化传代，每周传代1—2次，细胞维持在对数生长状态。
2、克隆形成率分析法：
Ham’s F—12(15％ FBS)培养液。96孔培养板每孔细胞的接种数根据细胞植盘率(Plating efficiency，PE)调整。加干预因素，孵育箱培养4周，倒置显微镜下观查，每孔活细胞≥32个的孔作为阳性孔而计数。
3、Western blot方法：
检测人HNSCC细胞ErbB家族成员蛋白表达和活性。细胞裂解液以相同蛋白量上样，SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别进行一抗、二抗杂交，ECL显色。
4、RT—qPCR方法：
检测人HNSCC细胞ErbB家族成员mRNA表达。
(1) Primer Express software设计引物和Taqman探针。
(2)利用Trizol试剂提取细胞总RNA。
(3)重组质粒pEBS7—EGFR作为标准品，actin为对照。
三、实验分组
1、96孔培养板克隆形成率分析法检测HNSCC细胞对三种药物(Cetuximab，Gefitinib，Cisplatin)的敏感性(IC70和IC50)。
实验设细胞对照组和药物(5种不同浓度)处理组。
2、96孔培养板克隆形成率分析法检测HNSCC细胞对Cetuximab或Gefitinib联合放疗疗效。
Cetuximab/Gefitinib+Radiation：
(1)单纯放射组：分0 Gy，0.75 Gy，1.25 Gy，2.5 Gy，5.0 Gy和7.5 Gy单次照射。
(2)放射+药物组：放射剂量同上。Cetuximab或Gefitinib IC70。
(3)放射+药物组：放射剂量同上。Cetuximab或Gefitinib IC50。
3、96孔培养板克隆形成计数法检测HNSCC细胞对Cetuximab联合顺铂(Cisplatin)及放疗疗效。
Cetuximab+Cisplatin+Radiation：
(1)单纯放射组：分0 Gy，0.75 Gy，1.25 Gy，2.5 Gy，5.0 Gy和7.5 Gy单次照射。
(2)放射+化疗组：放射剂量同上。Cisplatin IC70。
(3)放射+化疗+药物组：化放疗方法同(2)，Cisplatin IC70，Cetuximab IC70。
(4)放射+化疗+药物组：化放疗方法同(2)，Cisplatin IC70，Cetuximab IC50。
四、疗效评价与统计分析
1、细胞植盘率(PE)：
PE=—In(阴性孔数量/全部孔数量)/每孔使用细胞数量。
2、药物敏感性：
Cetuximab，Gefitinib，Cisplatin的敏感性用IC50，IC70表示，即抑制50％，30％克隆形成所需的浓度。
3、联合治疗疗效评价：
(1)细胞存活分数(Survival fraction，SF)=(阳性孔数量/每孔使用细胞数量)×控制组每孔使用细胞数量/控制组中阳性孔数量。适用于线性二次(LQ)模型F=exp[—(αD+βD2)]，拟合剂量生存曲线，(D表示剂量，α和β为剂量效应系数，α：为单击所产生的细胞死亡，即细胞存活曲线的初斜率；β：由于损伤累积而导致细胞死亡)。
(2)通过数值整合获得曲线下面积(Area under the curve，AUC)值等同于平均致死(失活)剂量，AUC=1/α+(1.0)(DF—1)。联合放疗AUC率=(药物+放疗)AUC/放疗AUC；联合放化疗AUC率=(药物+放疗+化疗)AUC/放疗AUC。
(3)联合治疗疗效评价采用细胞存活分数(SF)和AUC率的比较分析，比较分析采用t检验。药物剂量对超相加作用的影响采用单因素方差分析(ANOVA)。Cetuximab或Gefitinib联合放疗疗效和Cetuximab联合化疗(Cisplatin)及放疗的疗效评价采用“相加效应”(P>0.05)即药物+放疗(或放化疗)的附加效应；“超相加效应”(P<0.05)即大于药物+放疗(或放化疗)的附加效应亦即协同效应。
4、相关性分析：
ErbB表达与Cetuximab或Gefitinib药物敏感性(IC50)及放疗敏感性(AUC)的相关性采用Spearman统计分析，P<0.05为有相关性。
结论：
1、HNSCC体外研究表明，Cetuximab或Gefitinib联合放疗的疗效优于单独放疗(相加效应)，Gefitinib(5株超相加效应)对HNSCC细胞的疗效优于Cetuximab(1株超相加效应)。在Cetuximab联合放疗中，Cetuximab IC50剂量组作用最敏感的两株细胞与Cetuximab单药治疗中最敏感的两株细胞相一致。在Cetuximab联合Cisplain及放疗中，使用Cetuximab(IC70/IC50)和低剂量Cisplatin(IC70)可以提高疗效(相加效应)，优于单纯放疗或放化疗，并且超相加作用的两株细胞与Cetuximab单药治疗中最敏感的两株细胞相一致。结果提示Cetuximab的敏感性可以预测Cetuximab联合放疗或联合放化疗的疗效。
2、pErbB2和ErbB3表达水平与HNSCC细胞对Gefitinib抵抗性呈正相关；EGFR蛋白表达水平与HNSCC细胞对Cetuximab的抵抗性呈负相关；pErbB3表达与HNSCC细胞对放疗抵抗性呈正相关。提示pErbB2和ErbB3可预测Gefitirub抵抗性，EGFR可预测Cetuximab的敏感性，pErbB3可预测放疗抵抗性。
头颈癌;抑制剂;放化疗;疗效评价
中国医科大学
博士
病理学与病理生理学
邱雪杉
2008
中文
R730.261;R730.5
57
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）