细胞外基质裂解酶Heparanase-1与糖尿病视网膜病变新生血管形成的关系及作用机制研究
眼新生血管性疾病如角膜新生血管、早产儿视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等，是以糖尿病视网膜病变为首的一组严重危害患者视功能的常见致盲性眼病。新生血管的形成机制尚不十分清楚，目前亦无理想的治疗方法。在众多的促血管生长因子中，血管内皮生长因子在细胞增殖、迁移和黏附等信号转导的起始反应中起关键性作用，但是直接抑制VEGF及其受体并不能完全阻止病理性新生血管的发生，因而新生血管的形成是一个多因素、多途径参与的复杂病理过程，找到各种促血管生长因子的上游调控枢纽是阻止新生血管形成的关键。众所周知，细胞外基质在细胞接触、生长和分化过程中起重要作用，是各种细胞因子的“储存库”，其主要成分之一硫酸乙酰肝素蛋白聚糖由一个蛋白核心和数个与之共价连接的线性硫酸乙酰肝素侧链组成，其HS侧链可以结合、储存各种生长因子如：FGFs，VEGF和PDG等。在大血管中HSPG主要位于内膜和中层，而在毛细血管中主要位于内皮下的基底膜，促进内皮细胞的增生、迁移，以及稳定毛细血管的结构。乙酰肝素酶是一种内源性β-葡萄糖醛酸酯酶，是细胞外基质重要的裂解酶，HSPG是其特异性底物，Hpa识别HS侧链的特异位点，将HS降解为10-20个糖单位大小的短糖链，释放HS结合的细胞生长因子，在许多生理、病理过程如形态发生、组织修复、炎症、肿瘤新生血管形成和转移过程中起重要作用。因而，Hpa-1可能是控制各种活性细胞因子释放的上游枢纽。为我们研究病理性新生血管形成的机理提供了思路。
Hpa有两种基因亚型，Hpa-1与Hpa-2。两者有35％的同源性，其组织分布和细胞定位不同，可能有着不同的生物学功能。与新生血管关系密切的是Hpa-1，定位于染色体4q21.3。目前Hpa抑制剂的设计主要根据HS或其类似物。研究较多的是硫酸化磷酸甘露戊糖，PI-88在结构上与HS相似，与HS竞争性结合生长因子如：FGF-2和VEGF，阻止生长信号传递到细胞，抑制新生血管形成。PI-88的研究已进行到多中心Ⅲ期临床评价。
本课题拟观察糖尿病视网膜病变患者Hpa-1的表达及抑制剂PI-88在糖尿病视网膜病变中的作用，探讨Hpa-1与视网膜新生血管形成的关系及其作用机理。目前国内外尚未见Hpa-1与视网膜新生血管关系的研究报道。
第一部分糖尿病视网膜病变患者外周血中Heparanase-1的表达
目的：观察糖尿病视网膜病变患者外周血Hpa-1的表达，探讨Hpa-1表达与糖尿病视网膜病变的关系。
方法：50例糖尿病视网膜病变患者和15例健康人分为三组，Group1：正常对照组；Group2：非增殖期糖尿病视网膜病变组；Group3：增殖期糖尿病视网膜病变组。收集每位受试对象枸橼酸抗凝的外周血6ml，密度梯度离心法分离外周血中单个核细胞。应用免疫细胞化学染色、RT-PCR和Western Blot方法检测PBMC中Hpa-1的表达。
结果：mRNA水平，正常对照组、NPDR组和PDR组均可检测到Hpa-1的表达。经半定量分析，NPDR组、PDR组患者Hpa-1高表达，分别是正常对照组表达的1.28倍和1.33倍，差异具有统计学意义(P≤0.05)，NPDR与PDR组间差异无统计学意义(P≥0.05)。蛋白水平，PBMC的免疫细胞化学染色示Hpa-1阳性染色的细胞胞浆为棕色着染，通过400倍光镜下阳性细胞计数，三组的阳性细胞数NH组：24.80％±3.24％，NPDR组：54.97％±13.01％，PDR组60.49％±8.66％，NPDR组、PDR组与NH组比较差异具有统计学意义(P≤0.05)，NPDR与PDR组间差异无统计学意义(P≥0.05)；Western Blot分析，三组均可检测到Hpa-1基因65KD前体蛋白和50KD活性蛋白的表达，NPDR组、PDR组高表达Hpa-1，分别是NH组的2.88倍和3.18倍，差异具有统计学意义(P≤0.05)，NPDR与PDR组间差异无统计学意义(P≥0.05)。
结论：糖尿病视网膜病变患者外周血中Hpa-1高表达，提示Hpa-1可能参与了糖尿病视网膜病变的发生发展。
第二部分 Heparanase-1在糖尿病大鼠视网膜中的动态表达及与ICAM-1和VEGF表达的关系
目的：观察Hpa-1在STZ—糖尿病大鼠视网膜中的动态表达及其对ICAM-1、VEGF表达的调节作用，探讨Hpa-1的可能作用机制。
方法：8周龄雄性SD大鼠，腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠动物模型。分正常对照组、糖尿病两周组和糖尿病三个月组，糖尿病大鼠分别在STZ注射后两周、三个月处死。取大鼠视网膜组织，提取总RNA，RT—PCR方法检测Hpa-1以及ICAM-1、VEGF的表达。
结果：糖尿病2周、3个月的大鼠视网膜组织Hpa-1的表达分别是正常对照组的1.13倍和1.46倍；ICAM-1的表达分别是正常对照组的1.30倍和1.66倍；VEGF的表达分别是正常对照组的1.46倍和1.77倍。三组间Hpa-1、ICAM-1和VEGF表达均存在统计学差异(P≤0.05)。
结论：糖尿病大鼠视网膜组织Hpa-1表达增加，且与糖尿病病程呈正相关。ICAM-1、VEGF表达增加，与Hpa-1的表达一致。Hpa-1可能是ICAM-1、VEGF表达的上游调控因子而在糖尿病视网膜病变的炎症反应、新生血管形成过程中起重要作用。
第三部分Heparanase-1抑制剂PI—88在糖尿病大鼠视网膜病变中的作用及其视网膜毒性的研究
目的：观察Heparanase-1抑制剂PI—88在糖尿病大鼠视网膜病变中的作用及其视网膜毒性研究。
方法：8周龄雄性SD大鼠38只，STZ腹腔注射诱导糖尿病大鼠动物模型。随机分正常对照组(normal rat，NR，n＝8)、正常大鼠PI—88(25mg/kg/d，腹腔注射)给药组(NR+PI—88，n=6)、糖尿病组(diabetic rat，DR，n=8)、糖尿病大鼠PI—88(25mg/kg/d，腹腔注射)给药组(DR+PI—88，n=8)和糖尿病空白对照组(腹腔注射等量生理盐水，DR+NS，n=8)。糖尿病大鼠在STZ注射三个月后开始PI—88给药，在给药的0、7、14天监测大鼠体重和血糖。PI—88连续给药14天，所有大鼠行视网膜ERG检查后处死，摘除眼球，做石蜡切片、提取总RNA。其中NR组、DR组、DR+PI—88组和DR+NS组行ERG检查视网膜功能、免疫组织化学染色和RT—PCR方法检测视网膜Hpa-1和VEGF表达来评价PI—88治疗作用；NR组和NR+PI—88组ERG和石蜡切片HE染色后光镜下观察大鼠视网膜组织学变化来评价PI—88的视网膜毒性。
结果：PI—88以25mg/kg/d剂量腹腔注射14天，对所有大鼠饮食、睡眠和体重无明显影响。视网膜闪光ERG示DR+PI—88组较DR和DR+NS组a波、b波潜伏期缩短，振幅增加，差异有统计学意义(P≤0.05)。RT—PCR半定量分析示DR+PI—88组较DR组和DR+NS组视网膜Hpa-1、VEGF表达下降，其中较DR组Hpa-1、VEGF表达分别下降24.4％和30％，差异有统计学意义(P≤0.05)。视网膜毒性分析ERG示NR+PI—88组与NR组间a波、b波潜伏期、振幅无统计学差异(P≥0.05)；光镜下NR+PI—88组和NR组视网膜神经节细胞层均可见空泡形成，光感受器外层有断裂，与组织自溶程度一致，两组大鼠视网膜组织形态无差别。
结论：PI—88可以降低糖尿病大鼠视网膜功能的损害，抑制糖尿病大鼠视网膜组织Hpa-1的表达，下调VEGF表达，可能对视网膜新生血管形成有抑制作用。SD大鼠25mg/kg/d腹腔注射PI—88两周，无视网膜毒性。
第四部分 Heparanase-1在高糖条件下体外培养的人视网膜微血管内皮细胞中的表达及与ICAM-1和VEGF的关系
目的：观察Hpa-1在高糖条件下体外培养的人视网膜微血管内皮细胞(human retinal capillary endothelial cells，HRCECs)中的表达及其与ICAM-1、VEGF的关系，及PI—88对HRCECs增殖的影响。
方法：体外培养、鉴定人视网膜微血管内皮细胞，高糖(30mmol/l)条件下培养HRCECs72小时，RT—PCR方法检测Hpa-1、ICMA-1和VEGF的表达。MTT法检测PI—88(5μg/ml和10μg/ml)对正常HRCECs增殖的影响。
结果：成功培养了原代人视网膜微血管内皮细胞。高糖条件下HRCECs Hpa-1、ICAM-1和VEGF表达分别增加1.6倍、2.2倍和2.18倍，其表达上调可被PI—88(5μg/ml)显著抑制，P值分别为0.003、0.000和0.000(P≤0.05)。PI—88干预HRCECs24小时，各组细胞增殖率无统计学差异，(P≥0.05)；干预48小时，10μg/ml剂量组明显抑制HRCECs的增殖，P=0.036≤0.05；干预72小时，5μg/ml和10μg/ml剂量组均明显抑制HRCECs的增殖，P值分别为0.002和0.015(P≤0.05)。
结论：高糖上调HRCECs的Hpa-1表达，内源性Hpa-1参与调节ICMA-1和VEGF的表达增加。PI—88抑制HRCECs的增殖，且具有剂量依赖性。
糖尿病;视网膜病变;新生血管;血管形成;细胞外基质裂解酶;血管内皮生长因子
中山大学
博士
眼科学
唐仕波
2007
中文
R774.1;R587.2
75
2009-09-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）