苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒38K蛋白的核定位信号研究
杆状病毒可专性感染昆虫，苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)是杆状病毒的代表种。38K基因是在所有已测序杆状病毒基因组中均存在的31个核心基因之一。本实验室以前的研究表明，可表达AcMNPV38K—绿色荧光蛋白融合基因的重组病毒vAc38KGFP感染Sf9细胞24h后，融合蛋白开始入核，随后几乎所有的融合蛋白都集中在细胞核中，暗示38K存在一段可以使融合蛋白趋向细胞核的氨基酸序列。核定位信号(nuclear localization signal，NLS)往往由4-8个连续碱性氯基酸组成，可使携带该段序列的蛋白定位于细胞核中。在本研究中我们对38K的NLS进行了研究。
AcMNPV38K由320个氨基酸组成。根据36个秆状病毒38K同源物的氨基酸序列比对分析，可将38K分为3个保守区段：即a(aa1-aa52)、b(aa53-aa213)、c(aa214-aa320)。分别将编码a、b、c、ab、bc和全长38K的核莆酸序列与gfp基因融合，并克隆至瞬时表达载体pIZ/V5-His。将构建的瞬时表达质粒分别转染Sf9细胞，通过激光共聚焦显微观察发现：48 h后，含有c的融合蛋白定位于细胞核和细胞质中，而不含c的融合蛋白在细胞核中没有分布。用构建的瞬时表达质粒转染Sf9细胞6h后，霉用AcMNPV感染细胞，融合蛋白分布结果与瞬时表达检测结果相同。利用Bac—to—Bac外源基因表达系统，将上述不同的核苷酸片段通过位点特异性重组转座入AcMNPV bacmid中，构建了可表达不同38K片段—GFP的重组病毒。重组病毒感染sf9细胞，激光共聚焦显微镜观察发现：融合蛋白的分布与上述结果一致。以上研究表明38K的NLS可能位于c中。
将c中的部分碱性氨基酸分别点突变，即K251A、K254A、K269A、K289A、K228A/K229A/R230A、K258A/K263A、K291A/R292A共7个单独或者连续位点进行突变。按照与感染相同的方法感染Sf9细胞，在激光共聚焦显微镜下观察，结果显示：这些位点的突变并不显著影响38K突变体—GFP融合蛋白的入核。进一步的点突变位点的组合方式或者片段缺失将是继续探索38K NLS的必要步骤。同时，该实验也可能暗示了：38K作为核衣壳装配的重要基因之一，一旦它的功能不能正常行使，将影响到整个病毒的作用。因此，杆状病毒在其长时间的进化过程中配备了不止一套NLS。在NLS关键位点发生突变后，有一套另外的NLS可以暂时替代它起到引导蛋白入核的作用。
苜蓿丫纹夜蛾;核多角体病毒;38K蛋白;核定位信号;杆状病毒;点突变;共聚焦
中山大学
硕士
微生物学
程萍;杨凯
2009
中文
Q936
65
2009-09-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）